这篇研究性文章探讨了三阴性乳腺癌（TNBC）细胞在体外长期暴露于GPX4抑制剂（RSL3和ML210）并产生耐药性后，其体内转移特征的改变。研究发现，GPX4i耐药细胞虽然保持了在血液中存活和定植肺脏的能力，但在免疫健全小鼠体内自发形成远处转移的能力减弱。其肿瘤展现出独特的代谢和脂质组学特征，并趋向于一种上皮样状态（波形蛋白减少，上皮细胞粘附分子表达增加）。该研究强调了肿瘤微环境在塑造耐药细胞表型中的重要性，并指出铁死亡诱导疗法在转移级联反应的特定步骤中可能具有不同效果，为癌症治疗策略提供了重要启示。
《Advanced Science》：GPX4 Inhibitor Resistance and Metastatic Features in Triple-Negative Breast Cancer
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文章标题：GPX4抑制剂耐药性：塑造三阴性乳腺癌的转移景观与代谢重塑
编辑推荐：本综述深入探讨了三阴性乳腺癌（TNBC）细胞对谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）抑制剂产生耐药后，其体内转移行为的复杂变化。研究揭示，尽管耐药细胞能在血液循环中存活，但其从原发肿瘤自发转移的能力在免疫健全小鼠体内显著降低。文章系统阐述了伴随耐药性出现的独特代谢与脂质组学特征、上皮样状态转变，并强调了肿瘤微环境在其中的关键作用，为理解铁死亡（Ferroptosis）在癌症转移中的作用及开发相关疗法提供了重要视角。
摘要
尽管利用铁死亡（Ferroptosis）作为癌症疗法潜力巨大，但小分子铁死亡调节剂的生物利用度有限和全身毒性带来了挑战。本研究通过长期培养三阴性乳腺癌（TNBC）细胞系（MDA-MB-231和4T1）并使其对GPX4抑制剂（GPX4i）产生耐药，旨在探究这种体外获得的耐药性如何影响体内的转移特征。结果显示，与亲本细胞相比，GPX4i耐药细胞来源的肿瘤具有独特的代谢和脂质组学特征，且表现为向更上皮样状态的转变（波形蛋白减少，上皮细胞粘附分子表达增加）。这些耐药细胞形成的原发肿瘤自发转移到肺部的数量减少，但在静脉注射后，其总体转移负荷并无差异。这些数据表明，体外长期维持GPX4抑制剂压力会导致体内转移特征的改变。
1 引言
铁死亡是一种受调控的非凋亡性细胞死亡形式，正在被探索用于癌症治疗，但面临着包括小分子诱导剂的脱靶效应和缺乏有效体内临床前研究等挑战。三阴性乳腺癌（TNBC）作为一种侵袭性强、治疗选择有限的亚型，在体外和原发肿瘤中对铁死亡诱导表现出更高的敏感性。然而，铁死亡在TNBC转移能力中的作用仍知之甚少。GPX4是抵抗铁死亡的关键抗氧化防御酶，其小分子抑制剂（如RSL3和ML210）是铁死亡领域的基石工具化合物。癌症转移是一个涉及入侵、内渗、循环、外渗和定植的多步骤级联过程，每一步都使癌细胞面临不同的代谢和微环境压力。尽管靶向GPX4已被证明能抑制某些原发肿瘤的生长，但近期研究表明循环中的黑色素瘤细胞比原发灶细胞更依赖GPX4生存，这提示铁死亡诱导可能对转移级联的特定步骤特别有效。本研究使用RSL3和ML210作为工具化合物，探究体外长期暴露和对这些药物产生耐药如何影响体内的转移行为，旨在连接广泛的体外铁死亡文献与体内转移特征。
2 结果
2.1 生成对GPX4抑制耐药的TNBC细胞
通过在体外连续暴露于浓度递增的RSL3或ML210，历时三个月，成功生成了对GPX4抑制剂耐药（GPX4i）的4T1（小鼠TNBC）和MDA-MB-231（M231，人TNBC）细胞系。这些耐药细胞在GPX4抑制剂处理下存活率更高，并且对RSL3或ML210表现出交叉耐药，证实了其对GPX4抑制的广泛抵抗。
2.2 GPX4抑制剂耐药细胞系中铁死亡调节因子的体外表征
对关键铁死亡调节因子进行表征发现，RSL3R细胞中GPX4蛋白水平短暂性降低，而在停药（DH）后恢复。酰基辅酶A合成酶长链家族成员4（ACSL4）在耐药细胞中减少。铁死亡抑制蛋白1（FSP1）、胱氨酸/谷氨酸逆向转运蛋白（xCT）和谷氨酸-半胱氨酸连接酶（GCLC）的蛋白水平仅在M231 RSL3R细胞中增加。GPX4i耐药细胞对GPX4和FSP1的双重抑制表现出更强的抵抗。这些易于逆转的适应表明耐药表型可能并非由永久性基因改变驱动。
2.3 GPX4抑制剂耐药细胞与亲本细胞在体外保持相似的增殖速率
在体外，GPX4i耐药细胞与亲本细胞在增殖速率和细胞周期分布上均无显著差异。利用CRISPR/Cas9敲除Gpx4基因后，RSL3R和亲本4T1细胞在移除脂质过氧化抑制剂Liproxstatin-1后表现出相似的细胞死亡，表明GPX4对于耐药细胞的生存仍然是必需的。
2.4 GPX4抑制剂耐药细胞中脂质过氧化的升高在体外是可逆的
RSL3R和ML210R细胞中的脂质过氧化水平升高，但在停药（DH）细胞中未观察到，进一步强调了耐药表型的可逆性。胞质和线粒体/细胞核活性氧（ROS）水平在RSL3R细胞中保持不变。
2.5 GPX4抑制剂耐药细胞与亲本细胞在体外维持相似的氧化还原状态
GPX4i耐药细胞与亲本细胞相比，还原型谷胱甘肽与氧化型谷胱甘肽比值（GSH/GSSG）以及烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化型与还原型比值（NADP+/NADPH）均未观察到差异，表明其保持了正常的氧化还原平衡。
2.6 GPX4抑制剂耐药肿瘤的原发肿瘤生长减缓
将亲本细胞和RSL3R细胞原位移植到Balb/c（4T1）和NSG（M231）小鼠后，在4T1-Balb/c模型中，RSL3R肿瘤的生长速率与亲本肿瘤相似。而在M231-NSG模型中，RSL3R肿瘤的生长略有减缓。在另一个仅关注原发瘤生长的实验中，RSL3R和ML210R肿瘤在4T1-Balb/c模型中生长更慢。
2.7 GPX4抑制剂耐药肿瘤形成更少的远处转移
在手术切除原发肿瘤后，携带RSL3R肿瘤的小鼠在两种模型中均形成了显著更少的肺转移灶。在M231-NSG模型中，RSL3R肿瘤小鼠的远处器官（如肝、肾、胰腺和胃肠道）可见转移灶也更少。这种转移负荷的减少转化为显著的生存获益：携带RSL3R肿瘤的Balb/c小鼠在生存研究终点（第80天）保持健康且无转移迹象。尽管体内原发肿瘤细胞的脂质过氧化水平差异不大，但从肿瘤中分离出的RSL3R细胞在体外仍对RSL3和Erastin2处理表现出更强的存活能力，证实了其耐药性在体内得以维持。
2.8 GPX4i耐药和亲本TNBC细胞表现出相似的免疫浸润谱
将4T1亲本和RSL3R细胞移植到免疫缺陷的NSG小鼠中，尽管肿瘤生长和体重相似，但携带RSL3R肿瘤的小鼠转移灶有减少趋势，且生存期无显著差异。这表明在免疫健全Balb/c小鼠中观察到的生存优势可能涉及免疫系统。然而，流式细胞术分析显示，4T1亲本和RSL3R肿瘤在免疫细胞（CD45+）、T细胞、树突状细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和B细胞的绝对数量上无显著差异。
2.9 GPX4i耐药肿瘤在免疫健全模型中显示出独特的脂质适应
代谢组学和脂质组学分析显示，在Balb/c小鼠中，从RSL3R肿瘤分离出的癌细胞总脂肪酸和总磷脂含量增加，同时辅酶Q9（CoQ9，FSP1的已知底物）水平升高。空间脂质质谱成像（MALDI-MSI）进一步揭示了肿瘤区域与非肿瘤区域之间，以及RSL3R与亲本肿瘤区域之间独特的脂质分布模式。相比之下，在NSG小鼠中，RSL3R肿瘤与亲本肿瘤相比，脂质谱无显著差异，但与谷胱甘肽、精氨酸和一碳代谢相关的代谢物发生了显著变化。这些发现强调了代谢和脂质适应在不同肿瘤模型和微环境中的差异性。
2.10 GPX4i耐药的TNBC细胞能在血液中存活并定植肺脏
静脉注射实验表明，用Liprox（一种抗氧化剂）预处理M231细胞可增加其肺定植，提示脂质氧化限制了乳腺癌细胞在血液中的存活。然而，静脉注射后，M231 RSL3R细胞与亲本细胞在肺定植方面表现相似。同样，4T1 RSL3R细胞在直接静脉注射后也能在肺脏定植，且水平与亲本细胞相当。这些结果表明，RSL3R肿瘤缺乏自发转移并非由于在循环中存活能力受损，而可能是由于外渗或建立继发肿瘤的能力下降。RNA测序分析发现，GPX4i耐药细胞中与上皮-间质转化（EMT）相关的基因特征显著减少。蛋白质水平分析证实，间充质标志物波形蛋白一致性地在GPX4i耐药细胞系中降低，而上皮标志物E-钙粘蛋白和上皮细胞粘附分子（EpCAM）则在某些模型中增加。这些结果提示，GPX4i耐药肿瘤表现出更偏向于上皮样的表型，这可能有助于解释其自发转移能力下降。
3 讨论
本研究阐明了体外对GPX4抑制产生耐药如何影响TNBC体内的转移特征。GPX4i耐药肿瘤在免疫健全小鼠中转移潜能降低，但在直接静脉注射后仍能在血液中存活并定植远端部位，这表明耐药性可能与转移级联的早期步骤改变有关。研究观察到耐药肿瘤在免疫健全与免疫缺陷小鼠中表现不同，并存在明显的脂质和代谢重编程差异，强调了微环境在研究铁死亡耐药体内特征中的重要性。耐药性与更上皮样状态相关，这可能保护癌细胞免受脂质过氧化，但同时可能降低其内渗和形成自发转移的能力。此外，研究为重新解读基于GPX4抑制剂的体外基础研究提供了框架，强调了在考虑肿瘤-宿主相互作用的前提下，使用具有生物利用度的抑制剂进行针对性研究的重要性。本研究的一个关键局限是结论主要基于RSL3R模型，未来需要使用其他GPX4抑制剂和遗传模型来加强发现的普适性。总之，这些数据表明，体外长期使用GPX4抑制剂维持会导致体内转移特征的改变，提示在临床前研究中应仔细考虑铁死亡诱导剂对转移级联不同步骤的具体影响。
