《Allergy》：Integrated Methylome–Transcriptome Analysis Reveals Epigenomic Remodeling and Rho GTPase–Linked Immune–Epithelial Crosstalk in Atopic Dermatitis
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本研究通过对特应性皮炎（AD）皮损、相邻非皮损及健康对照皮肤的整合甲基化组、转录组和微生物组分析，系统描绘了AD皮肤的表观基因组（DNA甲基化）重塑景观。研究鉴定了数千个差异甲基化区域（DMR），并通过细胞类型校正模型区分了疾病相关的固有信号与细胞组成变化。研究进一步揭示了DNA甲基化变化与免疫-上皮基因共表达模块及金黄色葡萄球菌（S. aureus）定植的关联，一致性地突出了Rho GTP酶信号通路是整合AD中免疫、上皮和微生物相互作用的核心枢纽，为理解AD病理机制和精准干预提供了新见解。
1 引言
特应性皮炎（Atopic Dermatitis, AD）是一种常见的慢性炎症性皮肤病，其特征是免疫失调和上皮屏障功能障碍。尽管对AD皮肤的转录组变化已有很多研究，但DNA甲基化模式仍了解不多。表观遗传调控，特别是DNA甲基化，是细胞分化、免疫应答和疾病发生中的关键调控层。本研究旨在通过整合配对的表观基因组、转录组和微生物组数据，并结合细胞类型校正模型，来解决现有知识空白，从而揭示AD中协调免疫-上皮相互作用的分子过程。
2 材料与方法
研究基于临床特征清晰的欧洲MAARS（Microbes in Allergy and Autoimmunity Related to the Skin）队列。本研究纳入了AD患者和健康志愿者。从AD患者的后大腿病变部位（ADLES, n=40）和相邻非病变部位（ADNL, n=38）获取皮肤穿刺活检，并在健康对照（CTRLNL, n=40）的解剖匹配部位取样。参与者按年龄、性别和样本量进行匹配。通过Illumina Infinium MethylationEPIC v2 BeadChip和Affymetrix Human Gene 2.1 ST微阵列分别进行DNA甲基化和转录组分析。
2.2 DNA甲基化分析
原始IDAT文件在R中使用minfi和Enmix进行处理。经过严格的质量控制和探针过滤后，保留了916,534个探针用于下游分析。甲基化水平以β值和M值进行量化。技术协变量和通过去卷积估计的细胞比例被纳入所有后续差异分析的协变量中。
2.3 差异甲基化位点（DMP）的CpG水平分析
使用limma软件包在M值上进行CpG水平的差异甲基化分析。设计矩阵包括疾病组指标、机构、年龄、性别和技术特征。测试了以下成对对比：ADLESvs. CTRLNL, ADNLvs. CTRLNL, ADLESvs. ADNL。Benjamini–Hochberg FDR <0.05的CpG被认为是显著的。
2.4 差异甲基化区域（DMR）分析
使用DMRcate软件包进行DMR分析，应用了与DMP分析相同的线性建模框架。实施了三种建模策略：基本模型（无细胞类型协变量）、DNA甲基化校正模型（9细胞模型，包含甲基化解卷积细胞类型比例）和转录组校正模型（12细胞模型，包含转录组解卷积细胞类型比例）。显著DMR定义为区域水平多重检验校正后的谐波平均FDR（HMFDR）<0.05且平均甲基化差异绝对值>0.05。
2.5 使用Ingenuity通路分析（IPA）的功能富集分析
对每个对比中显著的DMR进行IPA“核心分析”，基于Benjamini–Hochberg调整p值识别显著通路。
2.6 从DNA甲基化数据进行免疫和结构细胞类型去卷积
使用两种互补方法估计细胞类型组成：EpiDISH用于估计免疫细胞分数，EpiSCORE用于估计皮肤结构细胞分数。这些估计的成分作为协变量纳入后续的甲基化建模中。
2.7 从基因表达数据进行白细胞去卷积
使用CIBERSORTx和LM22白细胞特征矩阵估计皮肤活检中的细胞类型组成。重点关注了12个具有显著丰度或变异性的免疫亚群，并作为协变量纳入差异甲基化模型。
2.8 加权基因共表达网络分析（WGCNA）
对转录组数据集中变异最大的前5000个探针进行WGCNA。确定了与疾病状态（病变、非病变、对照）强烈相关的基因模块。
2.9 DMR-模块相关性分析
为了识别DNA甲基化与基因表达模块之间的潜在调控关系，使用Pearson方法将DMR水平的β值与WGCNA模块特征基因（ME）进行相关分析。显著相关定义为|r| ≥ 0.6 且 FDR < 0.05。
2.10 直接DMR-表达耦合分析
为了评估甲基化-表达的耦合，将DMR的平均β值与映射基因的表达水平进行相关性分析。显著性定义为FDR < 0.05。
2.11 微生物组相关甲基化分析（金黄色葡萄球菌）
基于金黄色葡萄球菌的相对丰度，将样本分为无定植、优势定植或中间定植组。在仅包含无定植和优势定植组的甲基化模型中，测试金黄色葡萄球菌定植状态是否与AD病变皮肤的DNA甲基化相关。还评估了疾病严重程度（LOCAL SCORAD）与金黄色葡萄球菌相关甲基化特征的关系。
3 结果
3.1 AD亚组中不同的表观遗传景观
首先评估了ADLES、ADNL和CTRLNL之间的全基因组DNA甲基化模式。区域分析在人口学校正后，在每个对比中鉴定出大量稳健的DMR集合。主成分分析（PCA）证实了组间分离。Top-DMR热图突出了亚组特异性结构。通路富集涉及免疫和屏障相关过程，包括Rho GTP酶、凝血酶、NOTCH和细胞骨架程序。髓鞘形成信号通路也被富集，提示潜在的神经贡献。这些结果表明了共同的表观遗传机制以及病变与非病变皮肤之间的分歧。
3.2 细胞类型校正后表观遗传信号的稳健性
为了区分细胞组成变化驱动的信号与疾病固有的细胞内在信号，在DMR分析中加入了细胞类型协变量。使用甲基化来源的皮肤/免疫分数和基于LM22的免疫分数进行校正后，许多与对照相比的DMR仍然显著。值得注意的是，在基本模型中观察到的ADLESvs. ADNL的大型DMR集合在甲基化校正后完全消失，而在转录组校正后，一个较小但显著的子集仍然存在。这表明病变与非病变AD之间的主要表观差异是组成驱动的，而残留的集合代表了细胞内在标记的候选者。尽管进行了细胞校正，PCA仍然能区分各组，且Top-DMR的热图突出了亚组特异性特征。通路富集持续涉及免疫和屏障过程，包括IL-15产生通路、上皮膜蛋白信号传导、上皮粘附连接信号传导和整合素信号传导，Rho GTP酶信号传导也位于顶级典型通路之中。UpSet图揭示了共享的和亚组特异性的富集。
3.3 转录组和表观基因组的网络整合
转录组WGCNA识别出与疾病状态（病变、非病变、对照）强相关的基因模块，且不受机构、年龄或性别影响。这些疾病相关的共表达基因网络加强了转录组与AD病理学的相关性。转录组和甲基化数据的整合揭示了AD中基因表达模块与DNA甲基化模式之间的协调调控。转录组WGCNA鉴定了多个共表达模块，其中六个模块显示与DMR谱图显著相关。这些DMR相关模块富含免疫和上皮功能通路，包括NFAT介导的免疫调节、Th1信号传导、补体激活，以及通过Rho GTP酶循环和Rho GTP酶介导的formin激活进行的细胞骨架调节，表明AD中表观遗传和转录失调的趋同。MEbrown和MEturquoise显示出与细胞类型校正甲基化数据衍生的DMR谱图强相关。MEbrown代表一个免疫主导的簇，富含Th1/NFAT信号传导、补体激活和Rho GTP酶循环，而MEturquoise对应于一个上皮主导的簇，富含连接和角化基因。与这些功能一致，MEbrown与AD病变皮肤呈正相关，而MEturquoise呈负相关，反映了AD中协调的免疫激活和上皮下调。MEeigengene与DMR甲基化值之间的代表性相关性进一步说明了表观遗传和转录组信号之间的紧密耦合。此外，MEpink显示与疾病严重程度呈显著负相关。该模块强烈富集角化通路，表明角化相关基因的表达减少与更大的临床严重程度相关。
为了进一步研究DNA甲基化与基因表达之间的功能关系，分析了225个独特的DMR-基因对，这些对显示甲基化与宿主基因之间存在显著负相关。这些耦合变化与AD皮肤中选定位点的甲基化-表达耦合一致。一些DMR-基因对可能反映了增强子-启动子相互作用，而不仅仅是局部启动子甲基化。与这些DMR相关的基因的通路富集分析揭示了S100家族信号传导的富集，这是上皮抗菌防御和炎症的核心通路。此外，免疫和细胞因子信号通路也被过度代表，包括IL-10信号传导、IL-27信号传导和LPS/IL-1介导的RXR功能抑制。这些结果表明，AD中的表观遗传改变在功能上与控制免疫应答和上皮抗菌防御的转录程序相关，强调了表观遗传介导的宿主防御调控是疾病病理学的关键组成部分。
3.4 DMR与金黄色葡萄球菌丰度相关
鉴于金黄色葡萄球菌在AD中的临床相关性，本研究通过对比优势定植和无定植患者病变皮肤的DNA甲基化谱，研究了其对皮肤表观基因组的影响。使用转录组校正模型，鉴定出92个在优势和缺失丰度组之间存在显著差异的DMR。相反，当应用甲基化衍生的细胞类型协变量时，未检测到显著的DMR，表明观察到的信号依赖于调整策略。转录组校正模型的通路富集突出了免疫和屏障相关信号传导，包括Rho GTP酶循环、芳香烃受体信号传导、ESR介导的信号传导和白细胞外渗信号传导。对特定基因位点的检查证实了优势定植与无定植病变皮肤之间一致的甲基化差异。这些发现表明，金黄色葡萄球菌定植与AD皮肤中DNA甲基化景观的针对性重塑相关。为了评估临床相关性，检查了金黄色葡萄球菌丰度与疾病严重程度之间的关系。金黄色葡萄球菌相对丰度与总SCORAD和局部SCORAD均呈统计学显著正相关。在92个定植相关的DMR中，有70个也与局部SCORAD测量的疾病严重程度相关。这些严重程度相关DMR的通路富集揭示了重叠的免疫和信号网络，包括芳香烃受体信号传导、ESR介导的信号传导和Rho GTP酶循环，与金黄色葡萄球菌比较中发现的通路相似。对特定基因位点的检查证实了与局部SCORAD评分的强相关性。应用更严格的阈值得到了32个DMR，其中27个也与严重程度相关，强调了这些发现的稳健性。β值的增加通常对应于基因表达的减少。
总之，这些结果表明，与金黄色葡萄球菌定植相关的甲基化变化也与临床严重程度相关，强调了微生物负担与AD表观基因组重塑之间的联系。此外，AD疾病的恶化主要伴随着免疫和应激反应基因的低甲基化，这与活动性炎症期间的转录激活一致。
4 讨论
DNA甲基化整合了皮肤中的遗传和环境信号，影响细胞分化和编程、组织发育、屏障功能和免疫调节。在AD中，免疫-上皮相互作用是发病机制的核心，表观基因组可能介导将遗传风险与环境触发因素联系起来的持久分子改变。本研究整合了全基因组的甲基化组和转录组谱图以及互补的细胞类型校正模型，以定义AD皮肤中疾病固有的表观遗传改变及其与转录程序的关系。本研究的一个关键优势是使用了一个临床特征清晰的队列，并在三个国家的临床中心收集了解剖学标准化的皮肤活检。全基因组CpG水平分析揭示了AD病变、AD非病变和健康对照皮肤之间广泛的甲基化差异。在细胞类型校正后，许多DMR仍然显著，这表明很大一部分甲基化差异不能用细胞类型丰度的变化来解释。这些持续的信号指向病变和非病变皮肤中细胞内在的改变。相反，在人口学校正模型中检测到的病变与非病变皮肤之间的大量DMR在甲基化细胞类型校正后完全消失，这表明这两个部位之间的大多数差异是由于细胞组成的变化，而不是相同细胞类型内稳定的甲基化变化。本研究还通过整合转录组WGCNA模块与DMR谱图，确定了AD表观基因组和转录组之间的协调调控。几个共表达模块与DMR谱图显示出强相关性，将疾病相关基因网络与整个队列中的特定甲基化模式联系起来。在这些网络级关联的基础上，本研究进一步检查了特定的DMR-基因对是否显示出直接的甲基化-表达耦合。总共有225个DMR-基因对呈显著负相关，表明这些位点较高的甲基化水平与转录减少相关。这些DMR相关基因的通路富集分析揭示了S100家族信号传导的富集，以及IL-10信号传导、IL-27信号传导和LPS/IL-1介导的RXR功能抑制的链接。除了疾病固有的甲基化变化，本研究还调查了微生物定植状态是否与AD病变皮肤中的表观遗传变异相关。比较优势定植与无定植的金黄色葡萄球菌病变皮肤，并调整人口学和免疫细胞类型协变量后，鉴定出92个能区分两组的DMR。这些差异在调整了转录组衍生的免疫细胞类型比例后仍然存在，但在调整了甲基化衍生的细胞类型比例后消失，这表明信号可能反映了更广泛的皮肤驻留组成和上皮过程，而不仅仅是免疫浸润。重要的是，其中一大部分DMR也与局部疾病严重程度相关。这些重叠的信号表明，受微生物负担影响的部分AD甲基化组不仅反映了定植状态，还与疾病的临床表现相关。相反，与严重程度无关的DMR可能代表更稳定、定植特异性的表观遗传标记。本研究在不同分析层中出现的一个引人注目的信号是Rho GTP酶循环的反复富集。该通路持续出现在疾病固有的DMR、DMR相关的转录组模块和微生物相关的DMR中，强调了在不同独立分析层中的一致性富集。Rho GTP酶协调细胞骨架组织、细胞-细胞连接动力学和囊泡运输——这些过程对于上皮屏障完整性和免疫细胞功能至关重要。在角质形成细胞中，Rho信号调节肌动蛋白重塑、粘附、迁移和分化。在免疫细胞中，它们调节粘附、迁移和吞噬作用。该通路的失调会损害伤口修复，而RhoA的激活通过RhoA/ROCK级联促进金黄色葡萄球菌侵入上皮层。上皮、免疫和微生物影响在这一信号轴上的趋同表明，Rho GTP酶活性是连接AD病理生理学中细胞骨架重塑、连接稳定性和炎症的核心整合因子。
本研究存在一些局限性，包括其横断面设计、对去卷积可能仅部分捕获皮肤驻留异质性的批量组织的依赖，以及EPICv2阵列与全基因组亚硫酸氢盐测序相比的覆盖范围限制。本研究无法评估病变消退后甲基化改变的可逆性。需要纵向随访或治疗研究来确定观察到的甲基化改变是否代表永久性的、类似记忆的表观遗传重塑。尽管如此，匹配的、多中心和多组学数据的整合减轻了这些限制，并为未来的纵向研究和更深入的机制研究奠定了坚实的基础。
总之，本研究的整合甲基化组-转录组-微生物组分析表明了AD皮肤中协调的免疫-上皮程序，在组成校正后持续存在的信号提名了候选的固有标记。通过在网络级关联与甲基化和表达之间的基因级联系之间架起桥梁，本研究确定了可能驱动疾病持续性和异质性的候选调控回路。在不同分析中反复出现的Rho GTP酶富集，突显了一个合理的屏障和免疫过程整合因子，也是未来机制和治疗研究的可测试目标空间。将这些见解转化为靶向干预，可能为慢性炎症性皮肤病的精准治疗提供新的机会。
