《The Journal of Nutritional Biochemistry》：Guaiacol counters renal fibrosis via BMP/ERK/Smad1/5/9 signalling in UUO-induced chronic kidney disease
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肾纤维化治疗潜力：基于槲皮素computational pharmacology和UUO动物模型验证。摘要：采用网络药理学和分子对接预测槲皮素（Angelica sinensis）靶点，并验证其在体外（rh-TGF-β1刺激的细胞）和体内（UUO大鼠）的抗纤维化作用。机制涉及抑制NF-κB炎症通路及激活BMP/Smad抗纤维化信号轴，降低胶原蛋白、α-SMA表达及ERK/Smad磷酸化，改善肾功能和肾结构。
Hrushikesh Vikas Kulkarni | Anil Bhanudas Gaikwad
药学系，Birla 工程与科学学院，Pilani 校区，Vidya Vihar，Pilani，Rajasthan，333031，印度
摘要
慢性肾病（CKD）的特点是进行性纤维化和炎症，治疗选择有限。天然化合物因其潜在的肾脏保护作用而被研究，尤其是在 CKD 中。愈创木酚是一种基于木质素的多酚，也是Angelica sinensis（Oliv.）Diels 的主要成分之一，已被证明具有抗氧化和抗炎特性。因此，我们旨在探讨和分析愈创木酚在肾脏纤维化领域中的潜力，结合计算药理学并在实验中验证其效果，包括使用重组人转化生长因子-β1（rh-TGF-β1）诱导的大鼠肾上皮细胞模型以及 Wistar 大鼠的单侧输尿管阻塞（UUO）模型。通过靶标数据库识别了 CKD 和愈创木酚的靶标，随后通过蛋白质-蛋白质相互作用网络评估了它们之间的相互作用。此外，使用 Cytoscape 和 STRING 等软件进行的网络分析帮助识别了关键枢纽蛋白，并对其进行了基因本体论和通路富集分析。核心靶标以及抗纤维化蛋白与愈创木酚表现出强烈的结合亲和力，这一点通过分子对接研究得到了证实。体外研究表明，愈创木酚通过下调 ACE 和 p-NF-κB 水平表现出抗炎作用，进一步支持了计算预测。动物实验显示，连续21天给予愈创木酚显著改善了肾脏结构和功能参数，这一点通过生化和组织病理学发现得到证实。此外，免疫组化分析表明，愈创木酚抑制了关键纤维化蛋白（包括胶原蛋白、纤维连接蛋白和 α-平滑肌肌动蛋白）的表达，这些蛋白在 UUO 组中显著升高。此外，愈创木酚还显著降低了 ERK 和 Smad1/5/9 蛋白的磷酸化水平以及 Smad4，突显了其在调节 RAAS、NF-κB 介导的炎症和 BMP/Smad1/5/9 抗纤维化信号通路方面的治疗潜力。
引言
慢性肾病（CKD）是全球最常见的长期疾病之一，近年来发病率和死亡率持续上升 [1]。成人 CKD 的发病机制表现为肾小球滤过率（GFR）>60 mL/min/1.73 m2 或尿白蛋白排泄量 ≥ 30 mg/g，并持续超过12周。当前统计数据显示，全球 CKD 病例数约为8.5亿，且与 CKD 相关的死亡率不断增加 [2]。肾脏纤维化的主要特征是肾脏中促纤维化标志物（如胶原蛋白、弹性蛋白和纤维连接蛋白）的过度积累，导致结构损伤、肾脏血流量减少、肾小球硬化、肾小管间质纤维化、动脉硬化，最终导致肾衰竭 [3]。这一进程涉及复杂的病理生理机制，包括全身性高血压、多种生长因子和细胞因子的激活（特别是肾素-血管紧张素-醛固酮系统（RAAS）的激活）、血脂异常、足细胞丢失和糖尿。随着 CKD 的全球患病率上升，肾移植、肾脏替代疗法（KRT）和透析成为患病患者的主要治疗方法。因此，迫切需要寻找缓解间质纤维化的方法。
肾脏纤维化的关键分子驱动因素包括转化生长因子-β（TGF-β），它激活抑制因子 Smad2/3 信号通路；通过 AT1 受体（AT1R）激活的血管紧张素 II；结缔组织生长因子（CTGF）；纤溶酶原激活抑制剂-1（PAI-1）；以及核因子 κ-轻链增强子（NF-κB）等 [4]。目前的 CKD 治疗方法仅能延缓疾病进展，无法有效阻止或逆转纤维化。研究表明，作为 TGF-β 超家族的一部分，骨形态发生蛋白（BMP）通过 BMP/Smad1/5/8(9) 信号通路在 CKD 中表现出抗纤维化作用 [5]。此外，Smad4 作为在 TGF-β/Smad2/3 和 BMP/Smad1/5/9 之间传递信息的桥梁蛋白，在 CKD 状态下上调 [6]。因此，上调 BMP/Smad 信号通路同时破坏 Smad4 蛋白的干预措施可以有效地对抗 UUO 的纤维化效应。
天然产物和植物化合物在 CKD 治疗中展现出广阔的前景，与合成药物相比，它们具有多靶点治疗效果且副作用可能较少。特别是，多种植物化合物（如Glycyrrhiza uralensis中的异甘草素）可以抑制 Mincle/Syk/NF-κB 通路并减少肾脏炎症。Rhodiola rosea中的 Salidroside 可抑制 TLR4/MAPK/NF-κB 信号通路，而 Emodin 可促进自噬并抑制上皮-间充质转化（EMT）[7]。同时，为了有效治疗 CKD，正在开发新技术以准确预测新化合物的功效。网络药理学就是这样一种技术，它通过识别化合物的生物活性及其对 CKD 相关分子网络的协同效应来说明单一药物的多靶点作用 [8]。许多天然化合物，尤其是来自传统中医（TCM）的化合物，已在 CKD 病理生理学背景下进行了研究，并通过网络药理学得到验证，例如 Gramine、Guben Xiezhuo 汤和 Formonentin 等 [9]、[10]、[11]。
愈创木酚是一种含有甲氧基和酚基的木质素化合物，常见于Angelica sinensis（Oliv.）Diels（人参）干燥根部的酚类成分中。人参传统上被称为Dang Gui，被认为是最重要的中药之一，具有调节血流、缓解疼痛以及抗氧化和抗炎作用 [12]。此外，愈创木酚还被报道具有预防发热、成人多聚糖病、保护胃肠道和抑制破骨细胞生成等作用，其衍生物也显示出对抗肾脏纤维化的潜力 [13]、[14]、[15]、[16]、[17]。因此，由于其多样的药理作用，愈创木酚有助于预防和管理 CKD。
本研究系统评估了愈创木酚在 CKD 中的抗纤维化活性。通过计算药理学方法，我们识别了愈创木酚相关的靶标，并通过分子对接验证了它们的相互作用。随后在单侧输尿管阻塞（UUO）诱导的大鼠模型以及暴露于重组人转化生长因子-β1（rh-TGF-β1）的正常大鼠肾上皮细胞（NRK-52E）中的实验验证表明，愈创木酚显著减轻了炎症、间质纤维化和细胞外基质（ECM）沉积，同时降低了肾脏损伤生物标志物。机制上，愈创木酚通过上调 BMP/Smad1/5/9 信号通路并减少随后的炎症和氧化应激来发挥保护作用。总体而言，这项综合计算和实验研究展示了愈创木酚的治疗潜力，并提供了其作为新型肾脏纤维化干预措施的作用机制。
材料
愈创木酚（2-甲氧基酚，C7H8O2，CAS: 90-05-1）从 TCI Chemicals（#M0121，纯度 >98%）购买。用于检测肾脏损伤分子-1（KIM-1）的酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒（#E-EL-R3019）从 Elabscience（美国）购买，而肌酐（#Creatinine 200）和血尿素氮（BUN 200）的生化诊断试剂盒从 Accurex 购买。α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的一抗和二抗来自 Cell Signaling Technology（CST）。
愈创木酚的药代动力学和毒性特性
愈创木酚的化学结构如图 2A 所示。使用 SwissADME 评估了药代动力学参数（包括 ADME 特性），结果见表 1。评估表明愈创木酚符合 Lipinski 的规则，具有积极的药物相似性特征。同样，通过 ProTox-III 进行的计算机模拟毒性预测显示愈创木酚的毒性风险可以忽略不计（图 2B）。
愈创木酚对 CKD 的潜在作用靶标预测
全面的筛选过程包括
讨论
本研究阐明了愈创木酚的肾脏保护作用，这一作用在 UUO 诱导的梗阻性肾病大鼠模型中得到了体内验证，在 rh-TGF-β1 暴露的 NRK-52E 细胞中也得到了体外验证，这一结论基于计算机模拟网络药理学和分子对接分析的结果。愈创木酚通过减轻病理性的 ECM 沉积和 RAAS 激活、抑制 NF-κB 磷酸化介导的炎症信号而表现出令人鼓舞的肾脏保护效果
结论
本研究表明，愈创木酚通过改善肾功能、减轻纤维化和保护组织结构，对 UUO 诱导的肾脏损伤具有显著的肾脏保护作用。通过整合网络药理学、分子对接和实验验证（体外和体内），我们确定了关键分子靶标，包括 NF-κB1、ACE、NFE2L2 和 TP53，并确立了 BMP/ERK/Smad1/5/9 信号通路的调节作为核心抗纤维化机制。
资助声明
本研究未获得公共、商业或非营利部门的任何特定资助。
数据可用性
支持本研究结果的数据可应要求向相应作者索取。
伦理批准声明
本研究的动物实验按照 ARRIVE 指南和机构动物伦理委员会（IAEC/RES/36/05）的批准进行。
CRediT 作者贡献声明
Hrushikesh Vikas Kulkarni：撰写 – 原始草稿、软件开发、方法论设计、实验研究、数据分析、概念化。Anil Bhanudas Gaikwad：撰写 – 审稿与编辑、监督、概念化。
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
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致谢
A.B.G 感谢 Birla 工程与科学学院 Pilani 校区提供的财务支持，以完成这项工作。
