《Aggregate》：Sequence-Driven Modulation of the Multistage Self-Assembly Process in Lamellin-Type β-Peptides
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本研究聚焦于非天然异手性β3-肽的自组装调控机制，通过精确的序列单点突变（如亮氨酸L→丙氨酸A）和N端化学修饰（如丁酰基But→乙酰基Ac），实现了对多阶段自组装过程的定量控制。文章结合分子动力学（MD）模拟、透射电镜（TEM）和冷冻电镜（Cryo-EM）等技术，系统揭示了从寡聚体、原纤维到层状片、束状结构和宏观簇的五个连续形态阶段的演化路径。研究不仅阐明了β-肽骨架的“之字形”（zig-zag）构象在驱动组装中的核心作用，更展示了通过序列工程“定点”调控组装形态的策略，为开发具有可编程结构和功能的新一代仿生纳米材料（如药物递送、抗菌剂）提供了新范式。
1 引言
自组装是各种生物系统中普遍存在的过程，依赖于氢键、疏水或静电相互作用等特异性分子作用力，促使简单的化学构件形成有序的超分子结构。这些过程能够形成结构明确的组装体，在组织工程、药物递送、抗菌和抗癌剂、催化、纳米技术和材料科学等广泛的技术领域中具有多样化应用。在过去的几十年里，特别是基于肽的组装体，由于通过插入非天然的、外来的氨基酸可以实现高度的化学变异性及蛋白水解稳定性，受到了极大的关注。
对于天然蛋白质和肽而言，最简单的支架之一是淀粉样纤维，其中疏水性和亲水性残基发生分离。这些纤维与多种疾病相关，如阿尔茨海默病、2型糖尿病、心律失常和脑淀粉样血管病。此外，这些纤维也存在于细菌细胞、真菌和昆虫中作为结构成分，实现表面粘附、菌落形成或促进发病机制。使用β-肽可以实现类似于天然肽的组装。基于这些相似性，β-肽也可能为源于天然α-肽组装过程的神经退行性疾病的分子发病机制提供见解。
β-肽侧链的手性模式在高级结构元件的形成中起着至关重要的作用。自21世纪初以来，多个研究小组在β-肽与天然α-肽的二级结构，特别是片层结构的比较方面进行了开创性研究。基于这些先前的工作，完全由同手性氨基酸残基构成的β-肽倾向于形成螺旋，而异手性残基则促进极性或非极性片状或链状结构的形成。这些成就证明，完全由β-氨基酸构成或含有非蛋白源性氨基酸的肽在仿生组装体的设计中引起了极大兴趣，并可能作为新型纳米材料具有显著优势。
为了探索β-肽超分子组装的新方向，并受天然肽的延伸链构象启发，我们设计了几种短链、非环状的β3-序列。根据我们最近的研究，其中一些具有交替手性的序列显示出层状形态结构，形成带状片层，我们称之为层状肽（lamellins）。这些带有正电荷侧链的序列能够切割革兰氏阴性细菌的细胞包膜，从而显示出抗菌活性。
由于我们的目标是全面理解β-肽的组装行为，这里我们专注于整体电荷为中性的系统，其中超分子组织可以以可控的方式进行调节。特别是，我们专注于这些序列的末端亲脂区域，以研究疏水核心形成的操纵如何影响组装形成和最终形态。然而，游离的N端给系统引入了正电荷，这可能影响折叠、溶解度以及与其他分子或膜的相互作用。因此，选择了酰化，这可以中和该电荷并促进更紧密的堆积和稳定有序组装。
2 结果与讨论
2.1 合成设计
创造具有可控尺寸的超分子组装的挑战仍然是应用研究的焦点。其中，肽模拟物由于其结构可变性和对酶降解的敏感性较低而成为合适的组件。我们之前设计了一个疏水核心，以增强结构稳定性并通过疏水相互作用促进折叠。这样的核心可以支持适当的组装并减少构象灵活性，有利于形成明确的架构。为了防止形成无限的、有序的纤维，我们将异手性序列与N端的同手性单元相结合。这一特征预计会中断连续的β-链状堆积并调节系统的聚集倾向。因此，前两个残基保持同手性，而序列的其余部分包含交替的侧链手性。此外，为了增强膜结合，选择了具有疏水残基和N端非极性基团的β-氨基酸。
本研究中，我们以ButLeu（肽5）作为参考分子，并靶向改变序列的疏水部分以评估它们对组装形成的影响。所有用于本研究的六肽均采用固相合成法，使用Fmoc策略，在连续流动装置中合成，并通过分析型RP-HPLC和质谱进行表征。
总体目标是探索序列改变的影响，同时保留序列的寡聚化能力。此外，我们旨在探索疏水核心尺寸是否可以被调节以容纳不同大小的载药分子。因此，在合成之前，我们首先采用了分子动力学模拟，并将β-高丙氨酸突变引入到肽骨架的第2和第4位。此外，我们还修饰了N端基团，用乙酰基取代了丁酰基，预计这会影响疏水核心区域。为了估计这些突变对组装形成的影响，我们以系统性的逐步方式测试了这些变化，这导致了八种化合物，其中双亮氨酸-丙氨酸突变和丁酰基-乙酰基取代也进行了模拟。
结果基于肽的分子间氢键形成能力进行评估，并以模拟最后200纳秒期间的占有率显示。基于模拟，所有“突变序列”均能观察到单个肽分子的自组装；然而，组装形成的程度对所应用的修饰高度敏感。从But变为Ac的取代保留了相同的双层三明治型寡聚体，这可能是潜在高级组装的先决条件。通过在第2位用丙氨酸取代亮氨酸，对于丁酰化和乙酰化N端序列，仍然可以观察到三明治型组装的形成，这表明组装也是由氢键连接的肽的两层之间的疏水核心形成驱动的。另一方面，第4位的突变仅显示部分自缔合，主要导致三聚体和四聚体。我们还同时进行了第2位和第4位的双亮氨酸到丙氨酸突变，这导致寡聚体形成的倾向最低。
β-肽的骨架构象由三个扭转角φ、θ和ψ定义。上述序列中微小变化（即N端化学修饰或丙氨酸突变）的扭转效应也进行了彻底研究。对于研究的四种肽（ButLeu和AcLeu等），从残基2到5，在φ、θ和ψ扭转角中可以检测到交替模式，平均值为～+120，?60，+120（残基i）和～?120，+60，?120（残基i+1），支持之字形构象。这些结果表明N端保护基的修饰对二面角没有显著影响。然而，第2位的丙氨酸突变影响了这种交替模式，仅在残基3到5之间观察到。第4位的丙氨酸突变则消除了θ和ψ扭转角上的之字形构象，而从第2位引入额外的丙氨酸会增加结构的灵活性。
基于这些模拟，我们选择了四种序列进行进一步研究。此外，还对单个肽分子进行了额外的模拟，以排除它们形成螺旋的能力，因为这可能潜在地阻止由分子间氢键引导的进一步组装形成。值得注意的是，这对于更好地理解圆二色光谱和傅里叶变换红外光谱也是一个重要方面。所有测试肽和六种预定螺旋的模拟均显示，分子会展开成非螺旋的延伸结构。
考虑到分子动力学模拟的结果，我们合成了三种新的异手性六肽，并将它们与ButLeu一起进行形态和光谱表征。
2.2 形态和结构表征
2.2.1 序列修饰对自组装倾向的影响
基于我们之前的形态学结果，其中ButLeu的水溶液显示出由单个束组成的小型组装体，我们研究了温度、孵育时间和肽浓度对聚集体形成的影响。为了更好地理解并直接可视化聚集体内单个肽堆积的形态变异性，进行了负染透射电子显微镜和冷冻电子显微镜测量。
在新鲜溶解的ButLeu样品中，除了小的寡聚体外，在100 μM肽浓度下也能检测到更长和更宽的组装体。将ButLeu浓度增加到500 μM时，可以在新鲜溶解的样品中观察到形态变化。在这种情况下，类似的、较小的针状聚集体仍然存在；然而，也可以识别出长带状物和一些扭曲的细丝的出现。这些较大的细丝与先前在其他序列中观察到的层状图案相似。在37°C孵育72小时后，即使在100 μM浓度下，这些层状细丝也开始聚集成堆积的束。当浓度增加到500 μM时，束的宽度和数量呈现增长趋势。然而，即使在组装阶段，层状结构中的单个条纹堆积仍然可以追踪到。基于MD模拟，这些条纹对应于呈之字形构象的单个肽分子层，正如之前在层状肽-2K和层状肽-3K——磷酸盐缓冲液系统中观察到的那样。对于ButLeu，薄条纹的平均宽度为2.92 ± 1.22纳米，与先前类似的层状肽检测到的条纹在质量上有良好的相关性。此外，在孵育期后，可以在两个浓度下检测到薄纤维在层顶部形成束的预组织。冷冻电镜图像也证实了类似的形态阶段，同时存在小寡聚体、长纤维和片层。
通过将N端丁酰基替换为乙酰基这种最简单的修饰，得到的AcLeu显示出更明确和有组织的超分子结构，主要为扭曲的链状组装体。这里，所采用的浓度依赖性导致检测到的组装体数量直接成比例增加，而孵育时间导致一些聚集的扭曲网络的出现。与ButLeu类似，也可以检测到单独的暗条纹和亮条纹，平均宽度约为2.35 ± 0.71纳米。这些重复阵列的宽度比在PBS中观察到的层状肽-2K和层状肽-3K更薄，可能是由于交替堆积和缺乏磷酸基团。获得的更天然、玻璃化样品的冷冻电镜图像也证实了NS-TEM图像上观察到的这些扭曲链组装体的存在。在TEM和冷冻电镜图像中均观察到明确的扭曲周期性。
在ButAla的情况下，第二位亮氨酸到丙氨酸的突变导致层状层的形成，尽管与ButLeu相比，这些组装体的边缘更破碎。在37°C储存期后，排列良好的单个条纹变得更加明显。水相冷冻电镜图像在100和500 μM浓度下均显示出类似的层状层，与NS-TEM图像吻合良好。这些层状形态与我们最近展示的阳离子层状肽-2K和层状肽-3K肽非常相似。
对于AcAla，其中同时进行了But→Ac和Leu→Ala修饰，在新鲜溶解的样品中可以检测到多种结构。孵育72小时后，两个浓度下的组装体都变得更加明确，在100 μM浓度下可以检测到纤维状排列，而在更高的样品浓度下则出现束状结构。这些也显示出形态上的条纹图案，导致单个条纹平行排列。玻璃化的冷冻电镜样品显示出与NS-TEM相似的形态。
冷冻电镜和NS-TEM技术对组装形态产生了可比较的见解；然而，NS-TEM偶尔会显示出更高程度的扭曲，这很可能归因于样品制备过程中的空气干燥。
有趣的是，微小的差异，即N端基团的替换或丙氨酸突变，导致了显著不同的形态，尽管在所有结构中，单个条纹都被检测为一致的模式，很可能是每个肽良好组织组装的结果。这种结构很可能通过β3-高谷氨酸和β3-高赖氨酸侧链之间形成的分子内和分子间盐桥得到加强，正如之前在较小寡聚体中的之字形构象中所观察到的那样。动态光散射被用来支持在水中形成的组装体的存在。
2.2.2 突变对肽二级结构的影响
使用圆二色光谱和红外光谱方法研究了肽的结构特征。β-肽的远紫外光谱与二级结构的关联仍然具有挑战性，因为它们对微小的结构变化很敏感。尽管如此，基于我们之前的结果，记录光谱的相对比较仍然提供了有用的见解，并且通常应用于β-肽系统。
新鲜溶解的ButLeu在100和500 μM下显示出约205纳米的负带，同时在约195纳米处有一个正带，表明形成了非螺旋的、延伸的链状构象，类似于Martinek等人观察到的环状β-肽和el Battioui等人在PBS中观察到的层状肽-2K。与原始序列相比，AcLeu显示出不同类型的光谱，在约203纳米处有一个单正峰，类似于由交替的β2-和β3-氨基酸组成的六肽以及在PBS中的层状肽-3K。测试的两个浓度100和500 μM的峰值强度差异不显著，表明即使在较低浓度下也存在形成的组装体。在第2位引入丙氨酸突变后，得到的ButAla在研究的两个浓度下均显示出约211纳米的负带，且在195纳米以下有最大值。相反，经过组合突变后，新鲜溶解的AcAla在100 μM时表现出小的负峰，类似于在水中观察到的层状肽-2K，表明无规卷曲结构占主导。当浓度增加到500 μM时，峰值最小值移动到208纳米。
时间是组装体形成和稳定性的另一个重要参数。因此，我们跟踪了在37°C孵育时间对CD光谱形状的影响。有趣的是，当比较新鲜溶解的样品和在37°C储存72小时的样品时，在所有四种研究的肽的100 μM浓度下可以检测到轻微的强度变化。在更高的500 μM浓度下，对于AcLeu，没有检测到曲线形状和强度的变化；然而，对于AcAla，观察到了重大变化，移动到218纳米，最大值在202纳米左右，这是聚集的片状结构的特征。对于两种丁酰化序列，ButAla和ButLeu，检测到了轻微的位移和由于肽链聚集导致的峰值强度下降，这与NS-TEM观察结果一致。
还通过傅里叶变换红外光谱研究了二级结构和构象变化，重点关注酰胺I和酰胺II区域。傅里叶变换红外光谱记录在100和500 μM的储存样品上。ButLeu在酰胺I区域的最强带出现在约1650 cm?1，表明具有分子内氢键的延伸构象占主导地位。此外，还检测到弱和较强的肩峰。酰胺II带的加宽也被检测到，具有肩峰。将N端基团从丁酰基改变为乙酰基，增加了在约1664 cm?1的带强度，该带属于未作为氢键受体参与的酰胺羰基。ButAla的傅里叶变换红外光谱在约1646 cm?1处显示出相对较窄的酰胺I带。值得注意的是，在两个研究的浓度之间没有检测到可观察到的结构差异，这与CD和TEM结果一致。相反，500 μM的AcAla水溶液在约1625 cm?1处包含一个额外的强带，表明高度有序的、聚集的片状构象。
考虑到我们之前的核磁共振结果，这些结果表明，对于所研究的层状肽，螺旋结构不是优选的。然而，无规卷曲或之字形构象与分子间氢键的共存促进了片状排列，这将有利于延伸的层状形态，正如在TEM图像中检测到的那样。
2.2.3 组装形成的分子洞察
基于冷冻电镜和NS-TEM测量结果，结合额外的CD生物物理数据，我们能够沿着自组装过程识别五个不同的阶段。这些差异很可能源于潜在的构象和空间特性，这些特性高度依赖于所应用的序列。这些阶段从寡聚体开始，通过扭曲链，到更延伸的平坦片层，这些片层可以进一步聚集成束，并最终达到宏观簇。在这方面，肽序列中的细微变化的应用对于逐步操纵优选的组装阶段可能是递增的。值得注意的是，获得的显微图像也捕获了上述识别阶段之间的转换。
单独分析这些肽，对于原始序列ButLeu，从EM图像中识别出的组装体表现出五个阶段共存，从小寡聚体、扭曲链和片层，这些随着时间的推移积累成更长的宏观簇，这可以与两种弱强度CD光谱相关联。相比之下，AcLeu显示出更明确的结构，对组装体的偏好更窄，其中主要是扭曲链和片层存在，并且低强度CD信号随着时间和浓度持续存在。有趣的是，对于ButAla，我们只能检测到阶段III到V，主要是层状形态及其超分子簇，这也可以与强烈的CD光谱相关联，独立于浓度或储存条件。然而，对于AcAla，出现了扭曲链，这些链组装成束和宏观簇，在不同条件下表现出不同的CD光谱。
考虑到构象偏好的计算结果，可以清楚地看到，用AcLeu的更具亲水性的乙酰基替换ButLeu的疏水性N端丁酰基保护基团，保留了肽骨架扭转角的交替模式。同时，这也为乙酰化肽的θ和ψ扭转角提供了比丁酰化肽更大的灵活性。用β3-高丙氨酸取代β3-高亮氨酸导致第2位的扭转角更刚性，而第3和第5残基之间的交替模式仍然保留。基于这些结果，可以假设，由于其参与疏水核心的形成，丁酰基保护基团更喜欢更有序的结构，与更具亲水性的乙酰基形成对比，后者在空间上允许扭曲排列的形成。此外，较大的亮氨酸也倾向于促进扭曲组装体的形成，而更灵活的丙氨酸有助于形成更平坦的结构。因此，ButAla表现出有序的层状形态，AcLeu倾向于形成扭曲链，这是两个极端，在组装过程中偏好特定的形态阶段，而混合系统则显示出更广泛的阶段存在。
为了获得由两个形态极端代表的组装形成的直接原子水平洞察，基于我们在这些肽的MD研究中早期发现的八聚体结构，构建了32聚体模型。取决于β-氨基酸序列的灵活性，在模拟过程中沿着链出现了扭曲。单个肽仍然呈之字形构象，因此宏观扭曲似乎源于氢键连接的肽的相对排列。这种扭曲的程度与EM图像中观察到的形态相对应。关于尺寸，对于AcLeu，扭曲链的特征是具有明显的宽度和周期性，基于EM图像，宽度约为20–30纳米，长度为55–120纳米。这对应于约1.5–3.2°/纳米的螺旋螺距。相比之下，ButAla在EM图像中仅显示层状层形态，没有任何可观察到的扭曲。然而，从模拟结果获得的AcLeu的螺距值与测量的自然不同，可能是由于使用了简化的32聚体模型。
3 结论
在这里，我们设计并成功合成了几种短链层状肽型β3-肽序列，采用系统性的微小序列变化，以更好地理解和控制其高级超分子组装的形成。MD模拟证实了单个肽的之字形构象占主导地位，这促进了组装形成三明治型寡聚体。一旦这些组装成更高级的超分子，实验结果表明，N端乙酰基保护基团和第2位的高亮氨酸侧链促进了对扭曲形态的偏好。相反，N端丁酰基基团和第2位的高丙氨酸侧链有利于更有序的组装并减弱了沿纤维堆积的内部扭曲。基于综合的实验和计算观察，所采用的四种不同肽使我们能够沿着自组装过程识别五个不同的结构阶段，从寡聚体开始，通过扭曲链，到更延伸的平坦片层，这些片层可以进一步组装成束，并最终达到宏观片层簇。值得注意的是，引入的单点突变可以在所需的阶段停止自组装过程，为这些系统针对特定需求提供了多样化的适用性。这里实现的对自组装过程的控制有望为类似的淀粉样系统提供新的通用见解，这有助于开发自组装和共组装的肽系统，用于需要维持明确聚集形成阶段的广泛应用。
