《Aging Cell》：SIRT6 Regulates Protein Synthesis and Folding Through Nucleolar Remodeling
引言：衰老、SIRT6与神经退行性疾病
衰老是神经退行性疾病的主要风险因素，大多数病例是散发且与年龄相关的。三十多年来，研究焦点多集中于毒性蛋白质聚集体的形成，但这似乎是病理发展的晚期事件，针对聚集体的疗法在改善患者认知能力和预防记忆丧失方面收效甚微。另一方面，DNA损伤积累和表观遗传变化是衰老的关键驱动因素，但它们与蛋白质稳态（proteostasis）丧失的关系尚不明确。本研究以SIRT6作为大脑加速衰老的模型，观察其缺失如何触发核仁功能障碍，进而导致蛋白质稳态丧失。
SIRT6是一种核脱乙酰酶和单ADP核糖基转移酶，在DNA损伤反应、基因表达抑制等许多细胞过程中发挥关键作用。全脑或大脑特异性SIRT6敲除（KO）小鼠表现出DNA损伤增加、细胞死亡以及过度磷酸化和乙酰化的Tau蛋白增多等现象，与阿尔茨海默病（AD）动物模型及患者大脑的病理特征相似。有趣的是，SIRT6水平与活性在衰老大脑及AD患者大脑中均下降。
蛋白质稳态包括从核糖体形成到蛋白质折叠和降解的多层调控。翻译由核糖体完成，核糖体的核心结构——核糖体RNA（rRNA）在核仁中表达和初步形成。核仁生理功能在衰老和早衰症中受损，表现为核仁尺寸和数量增加，且核仁大小与寿命呈负相关。核仁前体rRNA转录的主要调节因子之一是核仁重塑复合物（NoRC），其组分之一SNF2H是一种染色质重塑因子，此前研究发现其能被SIRT6募集到DNA双链断裂位点的染色质上。
结果
SIRT6缺乏影响神经退行性通路，且与核糖体基因常见关联
对大脑特异性SIRT6敲除（brSIRT6KO）小鼠的脑转录组学分析发现，KEGG富集分析中18个显著下调的类别里有6个属于神经退行性病理类别，而最显著下调的类别是“核糖体（核糖体蛋白）”。将brSIRT6KO大脑与已发表的AD患者转录组数据进行比较，发现两组基因集存在正相关，核糖体类别以及阿尔茨海默病（AD）、亨廷顿病（HD）和帕金森病（PD）等类别在AD患者和brSIRT6KO小鼠大脑中均协同下调。
SIRT6缺失导致核仁失调和扩张
SIRT6可能通过其与SNF2H的已知相互作用以及后者在NoRC中的作用参与核糖体变化。NoRC由最大的组分TIP5（亦称BAZ2A）引导至rDNA。在brSIRT6KO小鼠大脑中，TIP5的RNA水平升高，但其总蛋白水平以及染色质募集均减少。SNF2H的染色质募集也明显减少。当测量SNF2H敲低时，TIP5染色质结合急剧减少，与SIRT6敲除结合后略微进一步降低。这些结果表明，SNF2H对NoRC的rDNA结合至关重要，且SIRT6和SNF2H对于TIP5的募集都很重要。
减少的NoRC染色质募集可能导致rDNA位点去抑制，并可能增加前体rRNA的产生。通过5-氟尿苷（FUrd）标记检测核仁转录，发现SIRT6缺陷细胞的核仁中rRNA产量升高。核仁大小和功能是已建立的衰老生物标志物，SIRT6缺陷可能影响核仁大小和功能。评估关键的核仁标志物核仁素（Nucleolin， NCL）和纤维蛋白（Fibrillarin， FBL）发现，在brSIRT6KO小鼠大脑中，NCL的mRNA水平显著增加，而FBL没有。在SIRT6敲除的SH-SY5Y细胞中，发现每个细胞核的总核仁面积增加，以及NCL的中位像素强度升高。在FBL中，总强度总和（积分强度）显著增加，但中位像素强度没有。在SIRT6敲除的HeLa细胞中过表达TIP5，显著减少了核仁扩张和升高的NCL活性，验证了所观察到的SIRT6缺陷中的核仁异常确实是TIP5/NoRC依赖性的。
为了确认核仁异常发生在有丝分裂后的神经元中，研究人员从成年野生型和brSIRT6KO小鼠的NeuN阳性皮质细胞中分离出细胞核。来自brSIRT6KO小鼠的神经元表现出NCL过表达。重要的是，每个细胞核的核仁数量呈现相似趋势：brSIRT6KO大脑的每个细胞核拥有明显多于野生型对照的核仁。
SIRT6缺陷细胞蛋白质合成增加
rRNA产量和加工增强可能导致翻译升高。使用SUnSET技术直接测量翻译速率，发现SIRT6敲除的SH-SY5Y、HeLa和HEK293T细胞中蛋白质合成速率均增加。为了验证SIRT6敲除导致的过度翻译是由核仁失调介导的，在TIP5过表达条件下重复SUnSET实验，发现其确实部分挽救了SIRT6敲除细胞中升高的翻译速率。用RNA聚合酶I（Pol I）特异性抑制剂CX-5461处理测量蛋白质合成速率，发现它也能挽救SIRT6敲除SH-SY5Y细胞中的翻译，而在野生型细胞中未检测到显著影响，支持了前体rRNA合成在SIRT6敲除依赖性过度翻译中的重要性。
对SIRT6缺陷的HeLa细胞进行多聚核糖体分析，发现多聚核糖体/单核糖体比率明显增加，表明核糖体活性升高。之前的研究发现，SIRT6缺陷的心脏组织由于翻译起始调节因子4EBP1的失调导致翻译增加。但本研究中观察到的翻译升高与翻译起始调节因子无关：测量4EBP1磷酸化发现SIRT6敲除细胞中没有差异。此外，测量SIRT6缺陷大脑中eIF2α活性也没有显著影响。这表明在机制上，翻译起始因子并非大脑中观察到的翻译速率变化的原因，而升高的核糖体含量才是。
为了支持SIRT6缺陷导致的蛋白质合成增加，细胞内氨基酸含量应该升高。brSIRT6KO大脑RNA-seq数据显示，许多氨基酸转运蛋白确实显著增加，这些转运蛋白共同覆盖了所有氨基酸。分析brSIRT6KO大脑代谢组学发现，在前25个富集的类别中，有10个与氨基酸和蛋白质代谢相关。对SIRT6敲除SH-SY5Y细胞的代谢组学分析支持了小鼠数据，因为大多数检测到的氨基酸的细胞内含量显著升高。
SIRT6缺陷损害蛋白质重折叠
蛋白质必须正确折叠才能发挥功能。折叠过程非常精细，通常需要一类特殊蛋白质——分子伴侣（molecular chaperones）的协助。虽然结果显示蛋白质合成速率升高，但伴侣蛋白和折叠机制相关的基因类别并未发生显著变化。手动检查brSIRT6KO RNA-seq中蛋白质稳态相关类别，发现分析中的33个蛋白质稳态和蛋白质折叠相关类别没有显著变化。在验证几种伴侣蛋白的蛋白水平时，即使各种翻译和蛋白质折叠相关压力通常伴随着伴侣蛋白机制的显著增加，也未发现任何显著增加。因此，无法检测到伴侣蛋白网络的系统性变化。
推测尽管有大量新翻译的蛋白质，但折叠机制的支持不足，导致错误折叠蛋白质的积累。为测试这一点，使用基于萤光素酶的热休克恢复实验测量了细胞重折叠错误折叠蛋白质的能力：萤光素酶对热非常敏感，诱导热休克会降低其活性。具有正常蛋白质稳态机制的细胞会随着时间的推移设法将其重新折叠——这一特性通过其活性来测量。结果表明，HEK293T野生型细胞能够恢复约60%的海肾萤光素酶活性，而SIRT6敲除细胞仅能恢复约20%。为验证恢复能力降低是由过度翻译驱动的，用翻译减弱剂处理细胞。之前的研究证明4-苯基丁酸（4PBA）是一种保守的蛋白质合成抑制剂，与文献报道相反——其作为化学伴侣的作用很小或没有。与假设一致，翻译减弱有助于SIRT6敲除细胞完全恢复其折叠能力。正如预期，这种处理将SIRT6敲除细胞中的翻译速率降低到与野生型相似的水平，进一步支持4PBA的挽救作用是通过翻译减弱实现的。
总之，SIRT6敲除导致的过度翻译并未伴随适当的折叠促进细胞环境，导致正确折叠新翻译蛋白质或重折叠错误折叠蛋白质的能力低下——可能对细胞产生有害影响。
SIRT6缺失导致蛋白质聚集增加
在正常情况下，持续未折叠或错误折叠的蛋白质会被降解；否则，它们可能积累成有毒的不溶性聚集体，这在神经退行性变中常见。通常，由于它们的大小，蛋白质聚集体通过自噬降解——这是SIRT6敲除中大量积累的错误折叠蛋白质的潜在命运。测量正常条件或应激下大脑和细胞系中的自噬标志物LC3，但未发现差异。
为了进一步了解SIRT6在聚集中的作用，使用了与EGFP融合的易聚集多聚谷氨酰胺（polyQ）载体（Q74-EGFP），该载体基于亨廷顿病（HD）聚集机制中的结构基序。首先，在SIRT6敲除的SH-SY5Y细胞中测量聚集。SIRT6缺陷细胞具有更高水平的Q74-EGFP聚集体，这些聚集体无法通过SDS凝胶迁移，因此卡在加样孔中，与野生型对照相比。因此，SIRT6敲除导致的过度翻译也伴随着聚集形成的增加。
接下来，在显微镜下观察EGFP阳性细胞，并通过EGFP信号的纹理（平滑度/粗糙度）测量Q74聚集，通过以无偏见的方式计算相邻像素之间的对比度。发现SIRT6敲除中纹理对比度显著增加，表明SIRT6缺陷导致更多聚集。
还手动将EGFP阳性细胞分为3个评分组：S0——无焦点或无颗粒化；S1——最多5个焦点或中等颗粒化；S2——超过5个焦点或严重颗粒化细胞。数据显示，SIRT6敲除导致S2部分增加，而S0群体减少。
线虫Sir-2.4 KO模型再现了SIRT6在蛋白质稳态中的作用
为了在完整的生理背景下测试SIRT6对蛋白质稳态的影响，通过敲除线虫中SIRT6的同源基因sir-2.4，开发了一个新的SIRT6缺陷模型（sir-2.4 KO）。与先前结果一致，这些线虫表现出核仁扩张和核仁活性升高，以及下游翻译速率增加，重现了细胞系中的结果。
为了在体内测试蛋白质稳态能力，用热休克刺激线虫，并在恢复24小时后测量瘫痪情况。发现N2（野生型遗传背景）线虫仅在成年第2天蛋白质稳态崩溃后，才出现热休克驱动的瘫痪增加，从约30%增加到约88%的线虫瘫痪。然而，sir-2.4 KO线虫即使在成年第1天也表现出对热休克的耐受性差——在预期的蛋白质稳态崩溃前就有约55%的瘫痪。这些数据表明SIRT6/sir-2.4在翻译调控和蛋白质稳态维持中的作用是高度保守的，并且在sir-2.4缺陷动物中蛋白质稳态丧失过早发生。
此外，进行基于摆动的运动性测定，发现KO品系与野生型相比，呈现出更快速的年龄依赖性运动速率下降，提示sir-2.4缺失导致运动神经元功能衰退更快。为了进一步阐明sir-2.4在神经元蛋白质稳态中的具体作用，采用了线虫中神经元特异性表达40个谷氨酰胺重复（Q40n）的多聚Q蛋白质稳态应激模型。发现与遗传背景匹配的品系相比，运动性崩溃更早发生。有趣的是，两个品系在成年第3天达到了相似的运动速率。这些数据表明，在sir-2.4缺陷情况下，蛋白质稳态丧失变得更严重，并表现出恶化的神经退行性表型和早衰。
接下来，测试了翻译减弱剂4PBA治疗能否挽救Q40n运动性损伤。由于sir-2.4 KO在成年第1天即已影响处于蛋白质稳态应激下的线虫，因此在成年期前的最后幼虫阶段L4开始4PBA处理。重要的是，首先验证了4PBA在线虫中具有与先前在其他模型中展示的相同的翻译减弱效果。野生型和sir-2.4 KO品系在4PBA处理中没有表现出效果，因为这两个品系都处于预期的蛋白质稳态崩溃之前。另一方面，4PBA翻译减弱显著降低了Q40n和sir-2.4 KO;Q40n品系中的Q40n-YFP蛋白水平，并因此缓解了这些品系中的运动性衰退。这明确了翻译速率在多聚Q聚集中的关键作用。此外，4PBA将sir-2.4 KO;Q40n线虫挽救到接近未经处理的Q40n品系的水平，尽管未达到4PBA处理的Q40n线虫的程度。因此，这些结果支持了我们的假设，即sir-2.4缺陷导致的蛋白质稳态崩溃是由过度翻译驱动的。这些结果表明，药物性降低蛋白质合成可以减轻多聚Q相关的神经元功能衰退。
最后，进行了寿命测定，观察到sir-2.4的缺失对N2（野生型）线虫的寿命有轻微的负面影响。在多聚Q线虫品系中，Q40n表达如预期般缩短了寿命，而在Q40n基础上添加sir-2.4缺失进一步缩短了寿命——表明sir-2.4缺陷神经元对Q40n积累的敏感性增加。
值得注意的是，4PBA处理对N2和sir-2.4 KO线虫的寿命没有显著影响，但另一方面，它对Q40n有轻微的改善作用，并且对sir-2.4 KO;Q40n突变体有非常显著的效果。这些结果表明，翻译减弱对仅由聚集蛋白质引起的长期蛋白质稳态损伤的挽救效果有限。然而，当用4PBA调节sir-2.4 KO核仁驱动的过度翻译时，聚集的Q40n效应被显著抑制——这再次支持了我们关于SIRT6-核仁-翻译导致蛋白质稳态丧失的模型。
讨论
蛋白质稳态丧失是衰老和神经退行性疾病的标志之一。然而，在没有导致蛋白质聚集的突变的情况下，为何衰老过程中蛋白质稳态能力会下降尚不清楚。据我们所知，我们首次证明SIRT6的丧失（正如其在衰老和神经退行性变中所发生的那样）通过改变翻译与细胞折叠能力之间的平衡，导致了蛋白质稳态的丧失。此外，SIRT6的减少也可以解释衰老和神经退行性变中核仁扩张和聚集体的出现。
SIRT6水平的降低破坏了染色质重塑因子和调节因子的募集，导致转录升高和基因表达失衡，尤其是在核仁内。除了核仁转录升高外，核仁rDNA重复序列也特别容易受到DNA损伤。因此，在SIRT6缺陷的情况下，升高的转录速率——加上核仁扩张——可能增强了对DNA断裂的脆弱性。此外，在缺乏传感器SIRT6的情况下，DNA修复机制受损，使有害的DNA损伤、核仁扩张和核仁转录增加的循环持续下去。这个循环从数量上（通过影响核糖体产生）和质量上（通过引入突变）显著影响了蛋白质合成和稳态。
我们观察到SIRT6不仅调控之前报道的帽依赖性翻译，还调控整个核糖体的调控。SIRT6缺失后，rRNA合成和加工增加，但核糖体蛋白基因没有相应增加，干扰了这些核糖体组分之间的化学计量平衡。我们推测这不仅会导致我们在此观察到的总翻译速率急剧升高（因为总体上核糖体更多），还会导致核糖体翻译哪些转录本的选择失调，从而影响翻译的效率、调控和mRNA特异性。然而，SIRT6缺陷对转录本选择的具体影响仍有待确定。
尽管SIRT6缺失时翻译增加，但伴侣蛋白和蛋白质折叠相关基因几乎没有变化，导致正确折叠蛋白质的能力恶化——这是每个细胞中关键的机制。重要的是，多聚谷氨酰胺模型揭示，在SIRT6缺陷的情况下，易聚集应激会导致更高的聚集。SIRT6在蛋白质稳态中的这些作用从线虫到人类都是高度保守的。
正如我们所展示的，观察到的蛋白质稳态降低可以通过翻译减弱来挽救，使系统恢复蛋白质合成与折叠机制之间的平衡。重要的是，FDA批准的药物4PBA的疗效表明了一种临床上可实施的药理学策略，可用于缓解SIRT6缺陷驱动的蛋白质错误折叠状况，无论是对SIRT6缺陷患者，还是在SIRT6随正常衰老而衰退的过程中。
SIRT6在调控蛋白质稳态中的作用在进化上是保守的——其在秀丽隐杆线虫中的同源基因sir-2.4也在翻译以及维持线虫随着年龄增长的热抵抗性和运动性方面发挥着关键作用。在线虫中，蛋白质稳态已知在成年第1天和第2天之间崩溃。本文表明，结合sir-2.4缺失和蛋白质稳态应激会使崩溃提前到第1天，明确了其在蛋白质稳态和健康中的关键作用。
虽然DAF-16/FoxO已被认为与线虫中sir-2.4介导的应激反应有关，但我们的研究结果在蛋白质折叠应激背景下提示了一种独特的机制。FoxO通常通过mTOR通路调控蛋白质合成并激活4EBP1，然而我们在细胞中未观察到4EBP1的变化。此外，在SIRT6敲除细胞或大脑中未检测到eIF2α磷酸化的显著变化，也未发现与自噬相关的LC3切割或总水平有任何改变。相反，增加的翻译（可被4PBA降低）似乎是驱动观察到的sir-2.4 KO线虫敏感性的原因，影响寿命并指向一条独特的调控通路。
先前的研究发现，DNA损伤会导致暂时的转录-翻译停滞，随后在DNA损伤修复后蛋白质合成增加——从而降低积累突变RNA和蛋白质的机会。在这里，我们发现SIRT6敲除导致翻译加速，绕过了这种重要的翻译减弱调控机制，尽管已知SIRT6缺陷中DNA损伤会增加。我们推测，SIRT6缺失对生物体如此有害，正是因为它造成严重的失衡：SIRT6缺陷细胞处于慢性DNA损伤状态，但由于SIRT6是DNA双链断裂的关键传感器，其缺失会损害修复。此外，SIRT6的缺失也损害了其作为基因调节剂的作用，导致表观遗传失调和核仁过度活跃。因此，DNA损伤和过度翻译的结合也可能导致受损DNA分子合成突变的RNA分子，这进一步加剧了SIRT6敲除中明显的蛋白质稳态丧失。随着SIRT6活性在正常衰老过程中下降，并在AD患者中进一步下降，这意味着一种机制，以多种方式助长了衰老和年龄相关脑部疾病中的蛋白质稳态丧失。
我们在多个模型和技术中展示了蛋白质合成的增加。然而，使用显微镜观察当前翻译的蛋白质显示出相当多的核信号，提示小分子嘌呤霉素标记的新生肽通过核膜扩散和捕获。虽然如先前报告所暗示，这可能是该方法的局限性，但也可能表明核扩散缺陷核糖体产物（DRiPs）的潜在标记——这些产物与核糖体错误或翻译过程中的缺陷有关。这在泛素-蛋白酶体系统相关降解的背景下可能特别令人感兴趣；然而，这超出了本工作的范围。
我们数据中的另一个限制是测量SIRT6缺失情况下的内源性蛋白质聚集率。基于多聚Q和萤光素酶的方法都使用外源性蛋白质稳态应激源，并未解决SIRT6敲除中基础水平的聚集/蛋白质错误折叠。遗憾的是，量化这些天然聚集体的技术限制使我们无法就SIRT6缺陷中的基础蛋白质稳态应激得出明确结论。
结论
我们展示了SIRT6在核仁调控和蛋白质稳态中的一个新作用。这一作用解释了蛋白质稳态丧失如何始于核仁失调，以及这种调控如何广泛影响下游的翻译和蛋白质稳态，导致在年龄相关神经退行性疾病中观察到的聚集体。我们建议，FDA批准的4PBA可以通过轻度降低蛋白质翻译，从而缓解蛋白质聚集体引起的神经退行性后果，为临床上可及的治疗途径提供可能。
