《Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle》：Disruption of Nuclear-Cytoskeletal Linkage by Coil-1a LMNA Mutations in Emery–Dreifuss Muscular Dystrophy
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本文探讨了埃默里-德赖弗斯肌营养不良症(EDMD)中由LMNA基因Coil-1a结构域突变（L35V、L38F、Y45C、L35P等）诱导的肌核多分叶畸形、核-细胞骨架(Nucleus-Cytoskeleton)连接破坏及肌核错位机制。研究发现，异常肌核形态破坏了BIN1（核定位蛋白）、Nesprin2、CLIP1、SUN1等蛋白的定位与相互作用，并导致力学感应(YAP1核转位)增强与核脆性增加。研究同时验证了突变特异性反义寡核苷酸(ASO)疗法在患者来源间充质干细胞(MSCs)中有效纠正上述核缺陷，为EDMD提供了精准的靶向治疗策略。
1. 引言
核纤层蛋白是中间丝蛋白，在动物细胞内核膜下形成网状结构，其中A型（如核纤层蛋白A）和B型对于维持核结构及与染色质或其他核蛋白的锚定至关重要。核纤层蛋白A由LMNA基因编码。大量LMNA突变已被报道，可导致包括肌肉营养不良在内的多种核纤层病，其中最常见的一组是肌肉营养不良，特别是埃默里-德赖弗斯肌营养不良症。EDMD的特征是多关节挛缩、缓慢进行性肌肉萎缩以及伴有传导缺陷的心肌病。其遗传模式包括X连锁、常染色体显性和罕见的常染色体隐性。LMNA突变导致的常染色体显性EDMD已被广泛报道。
核定位对于正常的细胞内组织至关重要，由核膜蛋白和细胞骨架控制。在骨骼肌中，细胞核通常位于肌纤维的外周以保护其免受收缩影响并最大化相邻核之间的距离，这对肌肉功能和维持很重要。异常的核定位与肌肉功能障碍和疾病相关。BIN1在通过连接核膜与微管和肌动蛋白细胞骨架来调控核定位中发挥作用。BIN1损伤可改变肌肉细胞中的核形态和位置。EDMD患者的肌肉活检也常显示肌肉纤维中心存在畸形核。然而，在没有核定位蛋白（如BIN1）基因突变的情况下，肌纤维中的细胞核是如何错位的，其机制尚不完全清楚。
本研究旨在探讨位于Coil-1A结构域的LMNA变异如何产生多分叶形核，异常聚集，破坏内源性核纤层和核-细胞骨架系统，改变BIN1定位，最终导致异常的核定位。我们进一步通过评估基因表达、力学转导和细胞活力的变化来评估这些形态学改变的功能性后果。同时，我们评估了突变特异性反义寡核苷酸方法在纠正EDMD患者来源细胞中不规则核变形的疗效。
2. 方法
所有实验方案均经釜山国立大学机构审查委员会批准。使用人类横纹肌肉瘤RD细胞和小鼠成肌细胞C2C12细胞作为主要模型。通过定点突变构建了携带EDMD相关点突变(L35V、L38F、Y45C)的Flag标签核纤层蛋白A变异质粒，以及野生型对照。通过CytoTune-iPS 2.0仙台重编程试剂盒将来自EDMD患者(L35P)和健康对照的成纤维细胞重编程为诱导多能干细胞，并使用STEMdiff间充质祖细胞试剂盒将其分化为间充质干细胞。
实验技术包括：免疫荧光成像分析蛋白定位和核形态；免疫印迹和亚细胞分级分离分析蛋白表达与分布；His/GST pull-down和免疫共沉淀实验分析蛋白质间相互作用；通过YAP1核转位评估力学感应活性；通过物理应力模拟和核破裂计数评估核脆性；通过MTT法评估细胞活力。使用ImageJ软件量化核轮廓比率（4 × π × 面积/周长2）以反映核形状畸变程度。设计了靶向L35P-LMNA的特异性19聚体ASO（5‘-GGAGGACCCGCAGGAGCUC-3’）和非靶向对照ASO，使用INTERFERin转染试剂将ASO转染入细胞。
3. 结果
3.1 EDMD相关核纤层蛋白A变异显示多分叶形核及结合亲和力受损
在RD细胞中过表达Coil-1a结构域的EDMD相关核纤层蛋白A变异体(L35V、L38F、Y45C)后，观察到显著的亚细胞核纤层蛋白A/C分布改变。与空载体对照和野生型核纤层蛋白A相比，突变体形成了多分叶形核和核出芽，且核纤层蛋白A/C在核质和细胞质中扩散。核轮廓比率显著降低（1.9–3.0倍 vs. WT）。突变体中磷酸化核纤层蛋白A/C (S22) 蛋白水平显著增加，该磷酸化形式据报道促进核纤层蛋白A/C解聚和降解。亚细胞分级分离显示，EDMD相关核纤层蛋白A突变体更容易扩散到细胞质和膜区域。长期过表达突变体显著降低了细胞活力。Pull-down实验表明，所有核纤层蛋白A突变体都丧失了与野生型核纤层蛋白A片段的组装能力，但突变体自身之间或与其他突变体之间结合强烈。在小鼠成肌细胞C2C12中也观察到了类似的核形态异常和结合缺陷。
3.2 核纤层蛋白A突变导致的多分叶形核诱发核定位蛋白BIN1的异常改变
研究发现，在表达核纤层蛋白A突变体的RD细胞中，BIN1的定位发生明显改变，聚集在核内角。Pull-down实验证实BIN1蛋白无法与核纤层蛋白A-L35V、L38F或Y45C有效结合。亚细胞分级分离显示，突变体中细胞质和膜部分的BIN1减少。BIN1的相互作用蛋白也受到影响：CLIP1（一种微管正端结合蛋白）的表达和定位发生改变；Nesprin2（一种核膜蛋白）在突变体中的核膜定位被破坏。这些结果表明，核纤层蛋白A突变体导致的多分叶形核诱发了核定位蛋白的错误定位，可能导致EDMD中的核错位。
3.3 EDMD相关核纤层蛋白A变异体中核膜与细胞骨架的相互作用解体
免疫荧光分析显示，在表达核纤层蛋白A突变体的细胞中，微管（α-微管蛋白标记）的架构发生改变，肌动蛋白丝也呈现密集网状结构和极性改变。核膜内蛋白SUN1在突变体中结构被破坏，不再定位于内核膜。GST pull-down实验证实，EDMD相关核纤层蛋白A突变体与SUN1 N端结构域的相互作用弱于野生型。SUN1蛋白的表达在突变体细胞中也降解了。这些结果说明，核纤层蛋白A突变导致的多分叶形核通过破坏核膜蛋白和细胞骨架复合体的稳定性，瓦解了核-细胞骨架连接。
3.4 EDMD患者来源MSCs显示核缺陷及核-细胞骨架改变
来自携带L35P突变EDMD患者的成纤维细胞重编程分化的MSCs表现出与RD细胞相似的多分叶形核。BIN1和γ-微管蛋白聚集在L35P-MSCs的核内角。细胞骨架（微管和肌动蛋白丝）的架构发生改变，核膜蛋白SUN1的结构破裂，emerin和核纤层蛋白B1在部分患者细胞中从核膜上缺失。蛋白质印迹分析显示，L35P-MSCs中内源性核纤层蛋白A/C、SUN1和CLIP1水平相对降低，而组蛋白修饰H3K9ac水平显著降低，提示染色质调控受损。免疫共沉淀显示，L35P-MSCs中核纤层蛋白A/C与SUN1或BIN1的结合减少。
在功能上，与正常MSCs相比，L35P-MSCs在轻度氧化应激下表现出更高的YAP1核转位水平（力学感应反应增强约1.72倍），表明EDMD相关突变增强了细胞对轻度应激的力学敏感性反应。此外，L35P-MSCs的基础核脆性更高，施加物理压力后核脆性进一步加剧（增加约20%），表明核膜稳定性显著降低。
3.5 靶向LMNA单点突变的特异性ASO改善EDMD细胞特征
设计并合成了靶向L35P-LMNA的特异性19聚体ASO。在RD细胞中，L35P-ASO能有效降低L35P-核纤层蛋白A的表达而不影响野生型表达，并缓解了由突变体长期过表达引起的细胞活力下降和多分叶形核。在EDMD患者来源的L35P-MSCs中，L35P-ASO治疗使多分叶形核恢复正常形态（轮廓比率恢复约1.97倍），SUN1重新定位于正常位置，BIN1定位也得以恢复。ASO治疗还恢复了L35P-MSCs中降低的SUN1和H3K9ac蛋白水平，并恢复了核纤层蛋白A/C与Nesprin2、BIN1的相互作用。此外，ASO治疗减轻了L35P-MSCs中观察到的细胞骨架紊乱、力学感应反应增强（降低约1.65倍）和核脆性增加（降低约11%）等细胞缺陷。
4. 讨论
本研究发现，特定的EDMD相关核纤层蛋白A突变体形成多分叶形核，进而损害核-细胞骨架结构并导致核定位蛋白错误定位。这些结构异常伴随着细胞力学和功能的改变，表明核形态缺陷超出了结构紊乱，延伸至细胞层面的功能后果。这与EDMD患者肌肉活检中经常观察到的畸形和错位核、伴随肌肉损伤和乏力的病理表型一致。
并非所有EDMD相关核纤层蛋白A突变都会导致严重的核变形。本研究中，位于Coil-1a结构域的L35V、L38F、Y45C及位于杆状结构域的R386K突变引起了多分叶形核及与野生型核纤层蛋白A的结合丧失；而H222Y和L530P突变则显示正常或轻度异常的核形态并维持了与野生型的相互作用。虽然因果关系尚未确立，但现有临床报告暗示这些结果可能与EDMD患者病理表现的严重程度相关。
核在细胞内的定位对于维持细胞结构、促进正常基因表达和确保有效细胞功能至关重要。在骨骼肌中，核通常位于肌纤维外周。BIN1通过连接细胞核与细胞骨架（如肌动蛋白和微管）在核定位中发挥重要作用。在突变细胞中，BIN1聚集在核角且无法与核纤层蛋白A变异体有效相互作用，这提出了一种可能性：由LMNA突变驱动的核形状异常可能间接影响核定位机制的功能，导致在没有BIN1突变的情况下肌肉细胞中出现核错位。微管组织中心的关键成分γ-微管蛋白在EDMD突变细胞中也异常地卡在核角。同时，微管和肌动蛋白丝的结构紊乱，以及LINC复合体的组分（包括Nesprin2和SUN1）在LMNA突变细胞中被破坏。这些发现共同表明，LMNA突变诱导的多分叶形核破坏了核-细胞骨架相互作用的完整性，最终导致肌核定位缺陷。
核的形态学改变与细胞力学和功能密切相关。由EDMD相关核纤层蛋白A突变引起的多分叶形核的形成与细胞存活率降低、核刚度下降以及力学转导和基因表达异常相关。然而，这种现象似乎并非所有LMNA突变的普遍后果。当核膜保持相对完整或未观察到多分叶核形态时，此类缺陷并不存在。本研究的一个局限性是这些发现可能仅限于特定的LMNA突变。
本研究使用患者来源的MSCs，因为它们源于中胚层谱系，具有分化为骨骼肌细胞的潜力。然而，我们承认MSCs并不能完全重现EDMD中观察到的终末肌肉表型。因此，目前的工作正在将患者来源的MSCs分化为肌源性细胞，以验证在更贴近疾病的肌肉环境中是否同样存在形态异常和功能缺陷。
为了探索LMNA相关EDMD的治疗方法，我们设计了针对突变特异性LMNA序列的ASO，以纠正突变诱导的核异常。L35P靶向ASO不影响野生型核纤层蛋白A，并有效挽救了EDMD患者来源MSCs中的多分叶形核，并重新定位了核膜组分和BIN1蛋白。此外，ASO治疗恢复了缺陷的蛋白质相互作用，促进了细胞骨架重组，并导致了细胞功能（包括力学感应和细胞活力）的恢复。尽管本研究证明了ASO有效降低L35P-核纤层蛋白A的表达，提示其作为EDMD治疗策略的潜力，但仍需进一步验证。特别是，ASO特异性靶向单点突变的能力应在肌肉细胞模型和LMNA相关EDMD的体内系统中进行评估，以确认其治疗效果。此外，必须仔细考虑潜在的脱靶效应和不良副作用。由于本研究评估了ASO治疗在单个LMNA突变背景下的潜力，因此该方法是否能广泛应用于EDMD相关的其他LMNA突变仍有待确定。尽管如此，目前的发现提供了有希望的证据，表明ASO介导的突变等位基因抑制可作为EDMD的一种可行治疗方法。
