《Archives of Insect Biochemistry and Physiology》：Molecular and Structural Characterization of Foam Proteins from Mahanarva spectabilis (Distant, 1909) (Hemiptera: Cercopidae) Nymphs Reveals Adaptive Features and Potential Targets for Pest Control
1 引言
热带畜牧系统中，牧草是反刍动物营养的主要来源。在巴西，臂形草（Brachiaria）和象草（Cenchrus purpureus）等因其高生物量生产力和对多样土壤气候条件的适应性而被广泛用作牧场。然而，其生产力和持久性受到害虫的严重威胁，尤其是沫蝉Mahanarva spectabilis（半翅目：沫蝉科）。该害虫对巴西畜牧业造成重大经济损失，每年因牧场减产和管理成本增加导致数百万美元损失。其成虫和若虫均造成危害。成虫取食叶鞘和茎秆，注入植物毒性唾液，诱导维管功能障碍并抑制光合效率。而若虫在根和根状茎上取食，并隐蔽在一团泡沫物质中，导致植株衰弱、生物量损失和牧场退化。
M. spectabilis若虫分泌的泡沫在其发育中扮演着至关重要的角色。这种充气基质提供了抵御捕食者的物理保护、热缓冲和保湿功能，从而创造了一个稳定的微环境以支持取食和生长。泡沫的成分分析表明，其主要由水（约90–95%）组成，其余部分包括脂质、碳水化合物、蛋白质和表面活性剂。这些成分被认为不仅有助于泡沫的结构稳定性和保水能力，还可能具有抗菌活性和酶调节等生物学特性。近期的研究还提示，泡沫可能调节植物的防御反应，潜在地影响昆虫定殖寄主植物的能力。
尽管泡沫具有生态和生理相关性，但M. spectabilis泡沫的生化组成仍未得到充分表征，因为既往研究大多集中于形态学和生物学方面。研究表明，某些牧草栽培品种表现出影响昆虫取食和发育的抗拒性和抗生性机制，这可能改变所产生泡沫的数量或组成。例如，抗性基因型可能减少关键泡沫蛋白的表达，从而影响若虫适合度，并为害虫防控策略提供见解。在其他沫蝉物种中，仅有少数报告探讨了泡沫分泌物的蛋白含量。与M. spectabilis的比较分析可能揭示保守或独特的蛋白谱，增强我们对跨沫蝉物种泡沫进化与功能的理解。
本研究的假设是，M. spectabilis的泡沫不仅作为物理屏障，还反映了其对寄主植物互作的生理适应。具体而言，泡沫蛋白质组可能在若虫发育于抗性或感病牧草基因型时存在差异。这些差异可能影响昆虫的生存、调节寄主的防御反应，或反映抗性互作中的生化反馈回路。识别这些蛋白可能促成靶向害虫防控策略，例如破坏泡沫稳定性或增强植物抗性机制。
2 材料与方法
2.1 植物侵染试验与泡沫样品采集
由巴西Embrapa Dairy Cattle提供Mahanarva spectabilis四龄和五龄若虫产生的泡沫样品。若虫被放置在3至4月龄的植株上24小时，植株用网袋覆盖以防逃逸，并在25°C和70%相对湿度的温室中保持直至泡沫形成。共采集了十二个样品，取自若虫侵染的四种牧草基因型：臂形草（BRI）、俯仰臂形草（DEC）以及象草栽培品种（Pioneiro—PIO和Roxo Botucatu—ROXO），每种基因型三个生物学重复。泡沫样品置于冰上，随后用液氮冷冻并储存在-80°C。
2.2 蛋白提取与定量
蛋白在10%十二烷基硫酸钠（SDS）缓冲液中溶解。使用二喹啉甲酸（BCA）测定法，以牛血清白蛋白（BSA）为标准品，测定蛋白浓度。
2.3 SDS-PAGE蛋白分离与光密度分析
使用12%分离胶，在变性条件下通过一维SDS-PAGE分离蛋白样品。等量总蛋白上样，电泳至最佳分离。凝胶用考马斯亮蓝R-250染色并脱色以显带。使用ImageMaster 2D Platinum软件进行光密度分析，基于积分光密度（IOD）量化每个条带。通过单因素方差分析（ANOVA）和事后多重比较检验评估处理间蛋白条带强度的差异。
2.4 转录组测序与蛋白质数据库构建
使用TRIzol?试剂从Mahanarva spectabilis若虫提取总RNA，用于构建蛋白质鉴定用的转录组数据库。经过质量评估的高质量RNA样本用于mRNA文库构建。使用Illumina平台进行测序。原始数据经过处理，生成干净的FASTQ文件，并提交至NCBI SRA。使用优化的转录组组装软件将高质量读段从头组装成contig。将预测的蛋白序列比对公共数据库（NR、Swiss-Prot、COG、KOG、KEGG）进行功能注释，使用InterProScan分配基因本体（GO）术语，使用HMMER鉴定Pfam结构域，从而构建用于下游蛋白质组学分析的全面参考蛋白质数据库。
2.5 LC-MS/MS蛋白鉴定
从考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE凝胶中手动切取感兴趣的单个蛋白条带。凝胶片段依次用碳酸氢铵和乙腈洗涤以去除残留染料。样品随后用10 mM二硫苏糖醇（DTT）在56°C还原30分钟，并在室温避光条件下用55 mM碘乙酰胺（IAA）烷基化30分钟。烷基化后，凝胶片段用乙腈脱水，在胰蛋白酶溶液（12.5 ng/μL，50 mM碳酸氢铵）中复水，并在37°C孵育过夜进行酶解。
干燥的肽样品在0.1%甲酸中复溶，并使用纳流超高效液相色谱系统（nano-UHPLC）串联Q-Exactive质谱仪进行分析。使用PEAKS Studio软件进行蛋白鉴定，结合从头肽段测序和数据库依赖搜索。用于肽段匹配的自定义数据库源自Mahanarva spectabilisRNA-Seq（Illumina）生成的转录组组装。搜索参数包括前体质量容差10 ppm和碎片质量容差0.02 Da。仅在肽段水平假发现率（FDR）阈值≤0.1%、蛋白水平≤1%，且由至少三条独特肽段支持的情况下才接受蛋白鉴定。
2.6 序列比对与系统发育分析
使用UniProt比对工具，通过Clustal Omega算法进行多重序列比对，以评估M. spectabilis泡沫中鉴定蛋白的序列相似性。所得比对用于生成系统发育树并可视化蛋白序列间的聚类关系。
2.7 AlphaFold3建模与结构预测
使用AlphaFold3实施结构建模和功能预测。对于每个鉴定出的蛋白序列，AlphaFold3流程基于融入物理和进化约束的深度学习算法生成高置信度结构模型。平台提供了每个残基的置信度分数、预测比对误差（PAE）和TM分数，用于评估生成结构的质量。TM分数>0.5的蛋白模型被认为具有可靠的全局折叠。通过与PDB中实验解析的结构进行比较来识别结构类似物，从而通过结构同源性推断潜在功能。
3 结果
3.1 泡沫样品中的总蛋白浓度
在四种不同牧草基因型（BRI, PIO, ROXO, DEC）上收集的Mahanarva spectabilis若虫泡沫的总蛋白浓度进行了量化。所有基因型的平均蛋白浓度范围约为0.49至0.66 μg/μL。尽管重复间观察到一些变异，但统计分析显示，不同植物基因型之间的总蛋白浓度无显著差异（p> 0.05）。这些发现表明，寄主植物基因型并未显著影响M. spectabilis若虫分泌泡沫的总蛋白含量。
3.2 不同寄主牧草基因型间蛋白SDS-PAGE谱的差异丰度
SDS-PAGE凝胶的光密度分析揭示了11个蛋白条带在取食不同牧草基因型的Mahanarva spectabilis若虫泡沫分泌物中的差异丰度模式。在所分析的基因型中，BRI被认为是抗虫的，PIO为中等抗性，而ROXO和DEC为感病。在抗性/中等抗性基因型（BRI和PIO）与感病基因型（DEC和ROXO）之间观察到条带强度的显著差异。具体而言，条带2、3、7、8和9在抗性/中等抗性基因型中表现出较低的相对丰度，表明这些蛋白成分可能与植物介导的抗性反应存在关联。相反，条带1、5、10和11在感病基因型（DEC和ROXO）相关若虫的泡沫中显示出丰度增加的趋势，这可能反映了对更易感寄主的生理或免疫差异。这些蛋白丰度的差异可能损害泡沫在抗性/中等抗性植物上的保护功能，潜在地降低若虫存活率，并为开发靶向害虫控制策略（如破坏泡沫稳定性）提供见解。
3.3 从差异条带通过LC-MS/MS鉴定蛋白
对11个差异丰度蛋白条带进行胶内胰蛋白酶消化和LC-MS/MS分析。使用PEAKS Studio针对Mahanarva spectabilis转录组衍生的蛋白质数据库进行蛋白鉴定。尽管SDS-PAGE提供了泡沫蛋白组成的可视化概览，但其有限的分辨率限制了其在比较研究中的应用。因此，选择PIO基因型（中等抗性寄主）的代表性凝胶用于图示目的。对于基因型水平的比较，采用高分辨率定量蛋白质组学LC-MS/MS评估差异蛋白丰度，具有更高的特异性和灵敏度。因此，并未生成或呈现所有四种基因型的SDS-PAGE凝胶，因为LC-MS/MS为比较蛋白质组学分析提供了更优的分辨率。
在多个条带中，PEAKS鉴定出不止一种蛋白，反映了具有相似分子量的多种蛋白的共迁移。对于每个条带，呈现了具有最高独特肽段数和/或最大序列覆盖率的蛋白。在比较SDS-PAGE观察到的分子量与编码序列（CDS）预测的理论分子量时，注意到了一些差异。在许多情况下，观察到的分子量低于预期，表明这些蛋白可能经历了翻译后修饰，如信号肽切割、蛋白水解加工或截短。例如，Gene|122372在三个条带（B7–B9）中被鉴定到，每个条带的分子量递减（~49, ~45, ~40 kDa），尽管其编码全长蛋白为50.57 kDa。这强烈支持了蛋白亚型或加工事件的存在，这些事件生成了结构相关的变体。
此外，某些基因（如Gene|122372和Gene|105027）在多个条带中重复出现，突出了泡沫蛋白质组中存在丰富的多功能蛋白。这些可能代表参与泡沫稳定、二聚化或与寄主/微生物分子相互作用的关键结构成分。这种冗余或重叠也强化了泡沫蛋白之间存在功能趋同的假说，即使它们源自不同的转录组来源。
尝试使用多个数据库和工具（包括基因本体（GO）、KEGG同源（KO）、KOG和Pfam）对鉴定蛋白进行功能注释。然而，由于现有参考蛋白质数据库中缺乏同源序列，未能检索到功能匹配。因此，所有高丰度鉴定蛋白均被归类为“功能未知”。这一局限性凸显了扩展半翅目昆虫基因组和蛋白质组数据库的必要性。
3.4 系统发育与序列相似性分析
基于矩阵的分析，如序列一致性和系统发育聚类，为泡沫蛋白的进化和结构组织提供了关键见解。系统发育树显示了三个不同的蛋白聚类，组内具有较高的序列相似性。这些聚类可能代表基因家族或旁系同源扩增，这些扩增可能进化以满足泡沫内特定的结构或保护作用。重要的是，这种分组得到了多重序列比对的支持，揭示了尽管蛋白长度或SDS-PAGE迁移率存在差异，但保守残基和结构域架构依然存在。在聚类01和02中保守结构域的一致检测，表明存在维持泡沫介导保护所必需功能元件的选择性进化压力。
Gene|122372等亚型的存在进一步提示了通过翻译后修饰或可变剪接进行的复杂调控，这一假说得到了信号肽预测的强化。最重要的发现之一是从同一个unigene（Gene|122372）衍生的肽段，在三个不同的蛋白条带（B7、B8和B9）中被鉴定到，对应的分子量分别约为49、45和40 kDa。尽管Gene|122372编码的全长蛋白理论分子量为50.57 kDa，但凝胶迁移率的多样性提示了蛋白加工事件的存在。在可能的机制中，SignalP算法预测了N端的一个典型信号肽及其切割位点。计算去除信号肽后，成熟蛋白的估计分子量为48.14 kDa，这与条带B8的表观质量一致。这支持了B7条带可能对应于未加工的全长形式，而B8代表切割后的成熟蛋白的假说。B9条带可能对应于蛋白水解切割或可变剪接衍生亚型产生的加工或截短形式。这些发现突出了分泌性泡沫蛋白翻译后加工的复杂性，并支持单个转录本可以产生质量和潜在功能不同的结构相关蛋白形式的观点。
3.5 聚类蛋白间的保守特征
聚类01中三个蛋白的详细序列比较揭示了高度的相似性，特别是在特定保守区域。尽管多肽链整体长度存在差异，但在所有三个序列中都鉴定到了几个保守结构域，表明可能保留了共享的结构或功能特征。这些保守结构域可能对应于对泡沫稳定性、黏附或与环境因子相互作用至关重要的基序，反映了维持基本功能的进化压力。
这种高相似性支持了功能保守的假说，可能反映了维持对泡沫功能或昆虫生理至关重要的作用的进化压力。这种保守性表明，这些蛋白可以作为靶点来破坏泡沫的保护特性，为害虫管理策略提供潜力。此外，源自同一unigene（如Gene|122372）的亚型的检测支持了翻译后修饰或可变剪接的存在，这些机制可以产生具有不同生物物理特性或调节功能的结构相关蛋白。这些发现表明，即使在存在结构分歧或不同分子量的情况下，关键功能域也可能得以保留，从而促成了在M. spectabilis泡沫蛋白质组中观察到的相似性。
3.6 聚类02蛋白的序列保守性
聚类02中另外两个蛋白的比较比对显示了显著的相似性，尽管多肽链长度存在实质性差异。热图突出了保守的氨基酸区域，提示了功能域的保留。与聚类01相比，这些序列之间观察到的较低整体百分比相似性可能归因于蛋白大小的差异。尽管如此，比对揭示了一些高一致性的离散区域，表明结构或功能相关基序的进化保守性。这些保守区域可能代表对泡沫保护基质至关重要的结合位点或结构元件，可能受到可变剪接或翻译后修饰的影响。
这些结果表明，为聚类01提出的相同进化机制，如结构域保留和功能趋同，也可能适用于聚类02。此外，热图中的比对模式可能反映了可变剪接事件，导致具有潜在不同调节或功能特性的结构变体。
3.7 使用AlphaFold对泡沫蛋白进行结构建模
AlphaFold3为Mahanarva spectabilis若虫泡沫中鉴定出的最丰富蛋白生成的结构模型显示出所有分析蛋白中普遍存在的扩展α-螺旋二级结构。已知α-螺旋能为细胞外环境（如泡沫基质）中的蛋白提供结构刚性和稳定性。尽管多肽长度存在差异，α-螺旋丰富结构的重复出现表明这些蛋白共享一个可能具有功能重要性的保守折叠模式。α-螺旋的这种持续存在提示了一个对于在泡沫环境中维持功能稳定性可能至关重要的保守折叠模式。
尽管蛋白之间存在差异，但核心结构框架似乎是保守的，表明存在保留功能域的选择性进化压力。值得注意的是，这种α-螺旋结构在生物系统中通常与黏附和支架形成蛋白相关，包括丝蛋白、胶原蛋白和载脂蛋白。其两亲性可能促进蛋白-蛋白和蛋白-脂质相互作用，增强泡沫的物理完整性和保水能力。这些结构特性也可以解释泡沫的抗降解能力及其黏附于昆虫和植物表面的能力。这些结构特征可能有助于泡沫保护若虫免受干燥、捕食者或微生物威胁，使其成为害虫控制策略的潜在靶点。蛋白间的结构相似性进一步支持了先前通过系统发育分析观察到的序列保守性，特别是在已识别的聚类内。
3.8 使用AlphaFold和Phyre算法对泡沫蛋白进行功能预测
为了进一步探索最丰富泡沫蛋白的结构和功能特性，使用AlphaFold3分析了预测模型。AlphaFold衍生模型使用比对指标（如e值和TM分数）与已知蛋白结构进行比较，以进行结构相似性搜索。尽管传统数据库（GO, KEGG, KOG, Pfam）缺乏功能注释，但当与已知分子功能的已知结构进行比对时，几种蛋白表现出中等至高TM分数（≥0.5）。这些结构比对允许基于与特征化蛋白结构域的相似性分配推定的功能作用。
例如，Gene|105027显示出与壳基质蛋白和Talin-1的结构相似性，提示其在细胞外基质形成或黏附中的作用。Gene|122372被预测含有WSC结构域，这些结构域可能参与渗透胁迫响应。壳基质蛋白（SMPs）通常与软体动物的生物矿化相关，以其组织稳定细胞外基质的能力而闻名，表明类似的结构支架功能可能在泡沫中被借用。Talin-1是一种细胞骨架连接蛋白，通过将肌动蛋白丝连接到整联蛋白复合体来促进细胞黏附；其与泡沫蛋白的结构相似性表明可能在将泡沫锚定到植物表面或若虫角质层方面起作用。WSC结构域（壁应力组分）常见于酵母和真菌中，作为渗透和机械应力的传感器，表明含有该结构域的泡沫蛋白可能有助于在环境挑战下维持水分平衡和结构弹性。
在这些蛋白中，Gene|105027可能稳定泡沫的物理结构，确保其黏附于植物表面或若虫，形成坚固的保护屏障。同样，具有WSC结构域的Gene|122372可能有助于维持水分平衡，保护若虫免受脱水或过度潮湿。该分析提供了有价值的结构背景，并支持了即使在缺乏直接序列同源性的情况下，泡沫蛋白之间存在功能保守的假说。
3.9 AlphaFold-Multimer预测Mahanarva spectabilis泡沫中最丰富蛋白可形成稳定二聚体
使用AlphaFold-Multimer模型通过ColabFold平台预测了与Mahanarva spectabilis细胞外泡沫相关蛋白的二聚化。基于内部置信度指标选择了最可靠的模型（排名001）。该模型呈现了约0.89的预测界面TM分数（ipTM）和0.86的预测TM分数（pTM），表明结构可靠性高，且对两个单体间相互作用的置信度强。二聚化可能增强蛋白稳定性，为配体创造结合位点，或促进更高阶结构的形成，潜在地有助于泡沫的黏性基质和保护功能。这些值表明了一种具有明确界面的生物学上可信的二聚体构象。
4 讨论
除了结构和生化分析外，在更广泛的昆虫-植物互作和害虫管理背景下理解Mahanarva spectabilis产生泡沫的生态学意义也提供了新的视角。在我们的蛋白质组学分析中，我们在泡沫中鉴定出了多功能蛋白，如载脂蛋白D-III、C1q结构域蛋白和WSC结构域蛋白，这些蛋白可能不仅有助于泡沫的物理结构，还有助于免疫防御、微生物互作和渗透调节。这些发现表明，泡沫是动态的生化界面，而非被动屏障，强化了其在若虫存活和环境适应性中的作用。
此外，黏附和基质形成结构域（如锚蛋白重复序列、S-层同源（SLH）和I/LWEQ基序）的鉴定，突出了高度的结构特化。基于AlphaFold3的结构预测提示这些蛋白能够二聚化并形成对泡沫内聚力至关重要的超分子支架。这些超结构可能受到进化压力塑造，以确保在干燥和微生物威胁等胁迫下的泡沫稳定性和黏附性。这种特化并不局限于M. spectabilis。对其他沫蝉物种（如Aphrophora alni）的比较研究揭示了具有黏弹性和环境黏附性的类似富含蛋白的泡沫。这些相似性强化了以下假说：跨半翅目物种的蛋白性泡沫是趋同进化的结果，旨在形成具有保护性、结构性和调节性功能的细胞外基质。
因此，在组成和结构水平上表征泡沫蛋白质组，揭示了害虫管理的潜在靶点。具有与微生物互作和表面黏附相关保守结构域的蛋白，可以使用生物防治剂（如金龟子绿僵菌）进行干扰，从而提高其效力。这些见解将分子昆虫学与可持续农业实践联系起来，强调了探索昆虫衍生的细胞外基质作为进化适应和应用性害虫控制靶点的必要性。
对Mahanarva spectabilis若虫产生的泡沫进行分子表征，为支持昆虫在其早期发育阶段存活的生化和生理适应提供了有价值的见解。尽管在不同寄主植物基因型产生的泡沫总蛋白浓度未观察到显著差异，但蛋白质组学分析揭示了蛋白丰度谱的重要定量差异。值得注意的是，当若虫取食抗性/中等抗性牧草基因型时，一些高丰度蛋白被发现下调。这些特异性变化虽然未反映在总蛋白含量上，但表明泡沫的组成和功能特性可能存在破坏。这种分子改变可能损害泡沫的保护功能，包括保湿、微生物防御和热缓冲，这些对于若虫在自然环境条件下的发育至关重要。在抗性/中等抗性寄主中，关键泡沫蛋白的下调可能代表植物诱导的胁迫反应或有限营养品质的间接影响，最终影响若虫在田间的存活。
有趣的是，当对从一维SDS-PAGE凝胶切下的单个蛋白条带进行LC-MS/MS分析时，所得肽谱图匹配到源自M. spectabilis转录组的多个不同unigene。即使在表观分子量显著不同的蛋白条带中也能观察到这一点。例如，匹配Gene|122372的肽段在B7、B8和B9条带中被检测到，尽管它们的表观分子量不同。这些发现提示了蛋白亚型或共享高度保守序列区域的不同蛋白的存在。这种情况可能反映了编码具有高度序列相似性的旁系同源蛋白的基因家族的存在，或者翻译后加工或降解产物保留了共同的肽段序列。这种复杂性表明，泡沫含有具有潜在重叠功能的多样化蛋白混合物，这对于其多方面的保护作用至关重要。
除了在一级氨基酸序列水平观察到的保守性外，我们的分析还揭示了在泡沫中鉴定出的几种最丰富蛋白之间，结构基序和功能域得到了显著保留。AlphaFold3预测模型的结构比对表明，尽管源自不同的unigene，但几种蛋白共享相似的三维折叠并具有保守的结构域架构。预测的结构相似性得到了许多蛋白对TM分数高于0.5的进一步支持，表明共享拓扑特征。例如，Gene|105027和Gene|122372均显示出与壳基质蛋白的结构同源性，而Gene|105031和Gene|105156则与载脂蛋白和Talin相关折叠相关。这表明这些蛋白在泡沫基质内执行类似的生物学功能，如脂质运输、黏附或细胞外稳定，可能受到维持泡沫完整性的进化压力驱动。
跨多个基因产物的结构和功能趋同可能反映了基因复制随后发生亚功能化或新功能化的进化过程，这是一种在昆虫中广泛记载的机制，特别是对于参与分泌和环境互作的基因家族。事实上，分泌蛋白（包括唾液效应物和泡沫相关蛋白）的扩展和多样化已在几个半翅目谱系中有所报道。这种保守性可能反映了强大选择压力的作用，以维持若虫细胞外防御中的功能冗余或稳健性，特别是考虑到泡沫对抗非生物胁迫和捕食的保护作用。
M. spectabilis若虫泡沫中多样化蛋白的存在表明，这种细胞外基质不仅仅发挥物理保护作用。几种已鉴定的蛋白，如载脂蛋白D-III和C1q结构域蛋白，已知通过脂质运输和微生物识别参与昆虫的先天免疫反应。这些蛋白可能保护若虫免受微生物病原体侵害，增强泡沫作为防御屏障的作用。Talin-1样蛋白和壳基质蛋白的检测可能表明其参与稳定泡沫结构，可能增强对植物表面的黏附或促进昆虫在泡沫内的锚定。
综上所述，这些发现表明M. spectabilis若虫分泌的泡沫代表了一种特化的、多功能的细胞外基质，富含结构和功能保守的蛋白。这些蛋白的组成和丰度受到寄主植物基因型的影响，其下调可能损害泡沫的保护功能。对负责泡沫稳定性和功能的分子成分的深入理解，为开发靶向这些关键蛋白以破坏若虫保护屏障并增强害虫管理策略的新型干预措施提供了机会。这项工作强调了整合蛋白质组学、结构生物学和生态学以全面理解昆虫适应性及其在可持续农业中的应用的重要性。
