《The FEBS Journal》：Variability in intracellular localization of D-amino acid oxidase in choroid plexus epithelial cells
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本研究聚焦于大脑脉络丛（CP）中D-氨基酸氧化酶（DAO）的亚细胞定位异质性。传统观点认为DAO主要定位于过氧化物酶体，但本研究通过高分辨率成像技术揭示，在脉络丛上皮细胞（CPECs）中，DAO不仅存在于过氧化物酶体，更广泛分布于高尔基体、内吞体、溶酶体、自噬体及外泌体等多个囊泡区室，提出了DAO通过高尔基体-内吞体通路进行胞内转运，从而高效代谢血源性D-丝氨酸的新机制。
D-氨基酸氧化酶（DAO；亦简称DAAO）是一种黄素酶，能催化D-氨基酸氧化生成相应的亚氨基酸和过氧化氢（H2O2）。在大脑中，DAO主要在小脑和脑干的胶质细胞中表达，负责代谢作为谷氨酸受体共激动剂和调节剂的D-丝氨酸。既往研究表明DAO也表达于脉络丛（CP）的上皮细胞中，但其亚细胞定位和功能意义尚不明确。
研究首先通过RT-PCR、Western blotting和免疫染色验证了所用抗DAO抗体对小鼠组织的特异性，确认DAO在小鼠肾脏、脉络丛及小脑等组织中表达，为后续定位研究奠定了基础。
抗体特异性及小鼠CP中DAO的表达
研究团队确认了抗DAO抗体可用于检测小鼠组织中的DAO。RT-PCR结果显示，小鼠DAO基因在肾脏和脉络丛中表达，但在肝脏中不表达。Western blotting检测到了预期分子量处的DAO条带，其表达模式与基因结果一致。免疫染色进一步证实，该抗体能在小鼠小脑的胶质细胞（通过S100β标记共定位确认）以及脉络丛上皮细胞中检测到特异性信号，而阴性对照则无信号。
DAO在小鼠脑中的分布
对小鼠脑矢状切片的免疫染色显示，DAO阳性信号存在于第四脑室和侧脑室的脉络丛中，这与在小脑、脑桥和延髓中观察到的信号模式一致。免疫电子显微镜观察发现，DAO阳性信号在CPECs胞体中呈囊泡样结构，其大小和形态各异，部分信号似乎被细胞膜包裹，提示可能存在吞噬作用。
DAO在细胞器中的定位
研究通过超高分辨率激光共聚焦显微镜（LSM900 with Airyscan 2）对DAO与多种细胞器标记物进行共定位分析，这是研究的核心发现部分：
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高尔基体通路：DAO信号与顺面高尔基体标记物GM130仅有轻微共定位，但与反面高尔基体网络（TGN）标记物TGN46则表现出相对广泛的共定位。这提示DAO可能通过TGN转运至不同细胞器。
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内吞体通路：DAO与多种内吞体标志物存在共定位。具体表现为，与早期内吞体标志物EEA1和Rab5a、回收内吞体标志物Rab11、多泡内吞体（MVEs）及外泌体标志物CD63和TSG101均有不同程度的共定位。其中，与早期内吞体和回收内吞体的共定位程度相对较高。
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溶酶体：DAO信号与溶酶体膜糖蛋白标志物LAMP1和LAMP2存在共定位。
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过氧化物酶体：DAO与过氧化物酶体靶向信号1受体PEX5存在中度共定位，但与过氧化物酶体膜蛋白PMP70仅轻微共定位，这与DAO传统上被认为是过氧化物酶体蛋白的认知部分一致，但也揭示了其定位的多样性。
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自噬体：DAO信号与自噬相关蛋白Beclin-1中度共定位，但与常用自噬体标记物微管相关蛋白1轻链3（LC3）仅轻微共定位。
定量共定位分析
为了量化DAO与各细胞器标记物的共定位程度，研究计算了皮尔逊相关系数（R值）和曼德斯系数。结果表明，DAO与TGN46、LAMP1等标志物的相关系数相对较高。曼德斯系数分析（M2值，代表DAO信号与细胞器标记物重叠的比例）显示，DAO与早期内吞体（EEA1, Rab5a）和溶酶体（LAMP1, LAMP2）标志物的重叠比例很高。相反，DAO与自噬体标记物（Beclin-1, LC3）的重叠有限。阈值化曼德斯系数分析进一步支持了这些发现。综合来看，DAO显示出与反面高尔基体网络、回收内吞体存在部分共定位，但与早期内吞体和溶酶体区室的重叠更显著且一致。
讨论
本研究的组织学分析揭示了DAO在小鼠CPECs中定位的多样性。结果显示，DAO不仅定位于过氧化物酶体，还存在于高尔基体、内吞体、溶酶体、吞噬体和外泌体中。这些发现提示，DAO在高尔基体成熟后，可能通过反面高尔基体网络转运，并在各种囊泡中发挥作用。换言之，溶酶体和吞噬体中的DAO可能负责代谢降解产物中的D-氨基酸，而内吞体和外泌体中的DAO可能被分泌到细胞外，在胞外代谢D-氨基酸。
研究提出了两种假说：第一，DAO分布在细胞多个部位，以便有效代谢其底物D-丝氨酸。考虑到脉络丛上皮细胞是脑脊液（CSF）的产生部位，DAO在CPECs中的核心作用可能是调节CSF中的D-丝氨酸浓度。第二，DAO可能作为上皮组织屏障功能的一部分。在肾小管上皮、内耳前庭上皮和小肠黏膜上皮等屏障部位也发现了DAO表达，表明其可能在调节各屏障部位的D-氨基酸方面发挥作用。CD63和TSG101的免疫染色结果提示，DAO可能通过反面高尔基体网络或外泌体途径被分泌。分泌的DAO功能可能是维持由CPECs调节的稳定D-丝氨酸浓度。
这些结果支持了以下假说：CPECs中的DAO在外周来源的D-氨基酸进入CSF之前对其进行代谢。本研究通过组织学手段可视化了正常小鼠脉络丛中DAO的定位。未来的研究需要在细胞水平上进行动态分析，并扩展到如精神分裂症等疾病动物模型，以进一步阐明相关病理生理机制。
材料与方法
本研究使用8-10周龄雄性C57BL/6J小鼠。所有动物实验程序均遵循日本动物护理指南，并获埼玉医科大学动物护理与使用委员会批准。研究采用了一系列技术手段，包括从肾脏、肝脏和脉络丛组织提取RNA并进行RT-PCR以验证基因表达；通过Western blotting和免疫沉淀验证抗体特异性及蛋白表达；对脑组织进行灌注固定并切片，用于免疫荧光和免疫电子显微镜分析。免疫荧光分析使用LSM900共聚焦显微镜配合Airyscan 2超分辨率成像系统，并利用Fiji（ImageJ）软件进行图像处理和定量共定位分析（计算皮尔逊相关系数和曼德斯系数）。免疫电子显微镜则用于在亚细胞水平上观察DAO的精确位置。
