《The FEBS Journal》：The malate–aspartate shuttle supports thermogenic lipid mobilization in brown adipocytes
编辑推荐：
这篇综述揭示了苹果酸-天冬氨酸穿梭（MASh）在棕色脂肪组织（BAT）中调控产热脂质动员的关键作用。研究表明，MASh不仅维持细胞质NAD+/NADH氧化还原平衡以支持糖酵解，更直接调节脂滴动态、甘油三酯储存和去甲肾上腺素诱导的脂肪分解。通过基因沉默关键线粒体载体Ogc或Aralar1（SLC25A12），该研究阐明了MASh在协调BAT能量消耗、线粒体生物合成与脂质代谢中的核心地位，为靶向代谢性疾病的治疗策略提供了新见解。
研究背景
棕色脂肪组织（BAT）是一种通过解耦联蛋白1（UCP1）介导的非战栗产热作用将能量以热能形式散失的产热器官。其高效产热需要持续的糖酵解通量，这依赖于细胞质烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）的再生以维持甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）的活性。哺乳动物细胞中，细胞质NAD+的再生主要通过乳酸脱氢酶（LDH）、甘油-3-磷酸穿梭（GPSh）或苹果酸-天冬氨酸穿梭（MASh）实现。然而，在产热活跃的BAT中，乳酸脱氢酶主要消耗而非再生NAD+，而GPSh则因游离脂肪酸对线粒体FAD依赖性甘油-3-磷酸脱氢酶（mG3PDH）的抑制而贡献甚微。因此，线粒体还原当量穿梭系统，特别是MASh，对于维持BAT细胞质NAD+供应、支持产热与代谢显得至关重要。尽管MASh在肝脏、心脏等代谢活跃组织中功能明确，但其在BAT代谢中的具体生理作用尚不清楚，尤其考虑到BAT同时利用脂质和葡萄糖进行产热，对细胞氧化还原态控制要求严格。
BAT中MASh的功能活性验证
研究首先通过小鼠组织特异性定量蛋白质组学数据集分析，证实了棕色脂肪细胞和分离的线粒体中存在MASh全部六个经典组分，且其表达水平与已知MASh功能明确的肝脏组织相当。酶活性测定显示，BAT中线粒体苹果酸脱氢酶（MDH2）活性显著高于肝脏，而线粒体谷氨酸-草酰乙酸转氨酶（GOT2）活性则较低，细胞质两种酶的活性在两个组织间相似。为直接评估MASh功能，研究采用了一种重建系统，将分离的BAT线粒体与细胞质MASh酶、NADH、天冬氨酸和谷氨酸共同孵育。实验结果显示，谷氨酸的添加以剂量依赖性方式驱动了线粒体外NADH的氧化，遵循经典的米氏饱和曲线，其appVmax为31.5 nmol NADH/min/mg蛋白，appKm为0.77 mM谷氨酸。经典的转氨酶抑制剂氨基氧乙酸（AOA）能强烈抑制谷氨酸诱导的NADH氧化。这些数据直接证明了MASh在BAT中是活跃的，并且明确地展示了其将细胞质还原当量（NADH）转移至棕色脂肪细胞线粒体的能力。
MASh关键载体基因沉默对棕色脂肪细胞分化和能量消耗的影响
研究进一步通过腺病毒介导的shRNA和小干扰RNA（siRNA）分别沉默了棕色脂肪细胞中对MASh至关重要的两个线粒体载体：α-酮戊二酸载体（Ogc/SLC25A11）和天冬氨酸-谷氨酸载体1（Aralar1/SLC25A12）。代谢组学分析显示，沉默Aralar1导致了天冬氨酸/谷氨酸比值的显著降低，表明MASh功能受损，而细胞质NAD氧化还原平衡（通过乳酸/丙酮酸比值反映）未受影响，暗示存在维持此平衡的代偿机制。沉默任一载体并未显著改变棕色脂肪细胞关键分化标志物如Ucp1、Elovl3和Prdm16的表达，但Ogc沉默导致脂肪甘油三酯脂肪酶（Atgl）、过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子-1α（Pgc1α）和线粒体转录因子A（Tfam）的mRNA水平显著增加，提示了细胞分化途径的部分重编程。
令人惊讶的是，通过Seahorse细胞能量代谢分析仪测量完整细胞的氧消耗速率（OCR），发现无论是沉默Aralar1还是Ogc，都未改变棕色脂肪细胞的线粒体代谢参数，包括基础呼吸、去甲肾上腺素（NE）刺激的呼吸、寡霉素抗性泄漏、ATP偶联呼吸以及依托莫西（etomoxir）敏感或不敏感的OCR部分。这表明在激活的棕色脂肪细胞中，MASh对于维持能量消耗并非必需，可能存在代偿机制。鉴于Tfam和Pgc1α等线粒体生物合成标记物在Ogc沉默细胞中表达上调，研究进一步检查了线粒体含量和形态。利用TMRE（用于Ogc沉默细胞）或MitoTracker深红（MTDR，用于Aralar1沉默细胞）染色并结合共聚焦显微镜观察与数字图像分析发现，两种基因沉默细胞均显示出单位细胞内线粒体面积的增加，但细胞总大小不变。有趣的是，Ogc沉默细胞中线粒体的长宽比增加、圆形度降低，表明线粒体发生了伸长，而Aralar1沉默细胞的线粒体形态未发生变化。
这些结果表明，虽然MASh在棕色脂肪细胞中活跃，但其功能受损并不会损害线粒体氧消耗。相反，MASh缺陷细胞似乎启动了线粒体生物合成的代偿性增加，很可能是为了通过克服NADH当量转移的减少来维持产热能力。事实上，当氧消耗速率根据线粒体含量进行归一化后，沉默Ogc或Aralar1均降低了NE刺激的以及寡霉素抗性的单位细胞器氧消耗。这进一步支持了MASh破坏引发的代偿性线粒体生物合成。Ogc沉默细胞中线粒体形态的改变进一步表明，这些新产生的线粒体在代谢上可能发生了重编程。
MASh调节棕色脂肪细胞的脂质代谢
鉴于Ogc沉默上调了Atgl和Pgc1α的表达，研究接下来探究了MASh是否影响脂质代谢。BODIPY 493/503染色显示，与对照细胞相比，Ogc沉默细胞含有显著更多的脂滴（LDs），但脂滴尺寸显著变小，而总脂滴面积（作为细胞脂质含量的替代指标）未变。重要的是，在沉默Aralar1的棕色脂肪细胞中也观察到了脂滴数量和尺寸的类似变化，这表明MASh在调节棕色脂肪细胞脂滴动态中起着作用。
脂滴的碎片化可能源于甘油三酯（TAG）合成的增加或TAG分解的增强。为了检测脂肪酸酯化是否增加，研究追踪了荧光脂肪酸类似物BODIPY-C12掺入脂质的情况。经过24小时脉冲、脂质提取和薄层色谱（TLC）分析，结果显示Aralar1和Ogc沉默细胞的基底TAG含量均升高。有趣的是，在NE刺激下，对照组和两种基因沉默细胞之间的TAG水平相似。这些结果表明，在非刺激条件下，MASh限制了脂肪酸的酯化。
MASh活性对于产热激活的脂肪分解至关重要
为了评估MASh缺陷对产热激活的脂肪分解的影响，研究开发了一种使用荧光标记脂肪酸的活细胞检测方法。棕色脂肪细胞用BODIPY-C12脉冲标记16小时，洗涤后，在BODIPY 493/503标记中性脂质的条件下追踪9小时，并使用高内涵共聚焦荧光显微镜成像。对照实验验证了该方法的有效性：脂肪分解激活剂NE和毛喉素加速了BODIPY-C12信号的丢失，而ATGL抑制剂Atglistatin完全阻断了信号丢失，脂肪酸氧化抑制剂依托莫西则无影响，确认了该检测方法特异性测量脂肪分解。
将此方法应用于Aralar1沉默细胞，结果显示NE刺激的脂肪分解被完全消除，表明急性脂肪分解激活存在缺陷。为了进一步验证这一观察结果，研究进行了更长时间的BODIPY-C12脉冲-追踪实验，随后进行脂质提取和TLC分析。在NE处理下，对照细胞显示游离脂肪酸（FFA）与TAG的比值增加，这是脂肪分解的指标，而Aralar1沉默细胞的这种反应较低。作为脂肪分解的二级测量指标，NE处理强烈增加了对照组细胞向培养基中释放的甘油，但这种反应在Aralar1沉默的脂肪细胞中被部分削弱。有趣的是，即使在Atglistatin存在的情况下，Aralar1沉默细胞释放的甘油仍然低于对照组，这表明MASh抑制可能激活了甘油利用的替代途径。
总结与讨论
本研究提供了直接证据，表明苹果酸-天冬氨酸穿梭（MASh）在棕色脂肪细胞中功能活跃，并支持脂肪分解，尤其是在肾上腺素能刺激下。这些发现揭示了MASh在调节棕色脂肪细胞脂质代谢中的先前未被认识的作用，超越了其在其他组织中维持细胞质NAD+氧化还原平衡的经典功能。虽然直接证据显示MASh破坏并未损害整体呼吸速率，但它触发了代偿性线粒体生物合成，并改变了线粒体形态（特别是在Ogc沉默细胞中）。重要的是，它导致脂滴碎片化，基底TAG含量增加，并显著损害了NE刺激的脂肪分解。
机制上，MASh与脂肪分解之间的联系似乎涉及对细胞质NAD+/NADH氧化还原平衡的调节。MASh活性通过细胞质苹果酸脱氢酶（MDH1）将草酰乙酸还原为苹果酸，促进了NADH向NAD+的再生。尽管理论上MASh活性降低会扰乱氧化还原稳态，但代谢组学数据显示，在MASh受损条件下，乳酸/丙酮酸比值保持不变，表明整体细胞质NAD+/NADH比值得以维持。这很可能是由于替代性线粒体穿梭（如甘油-3-磷酸穿梭GPSh）的代偿性活性增强所致。MASh的抑制可能增强了GPSh的活性，增加了甘油-3-磷酸（G3P）的周转，这反过来可能促进脂肪酸的酯化和甘油三酯的合成或再酯化，与研究中观察到的TAG含量上升和甘油释放减少一致。
研究还表明，MASh破坏导致的小脂滴积累可能损害了ATGL介导的细胞内甘油三酯水解。此外，甘油三酯的积累可能反映了由于水解受损而未被动员的脂肪酸的被动再酯化，而不是主动增
