《The FASEB Journal》：Reduced Versus Oxidized NAD+ Precursors Drive Distinct Transcriptomic, Proteomic, and Metabolic Profiles in Hepatocytes
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本研究通过RNA测序、蛋白质组学和代谢组学，首次在培养的鼠肝细胞中对经典的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)前体(烟酰胺核苷NR、烟酰胺单核苷酸NMN)及其强效还原形态(NRH、NMNH)进行了系统性的平行比较。研究发现，还原态前体不仅是更有效的NAD+增强剂，更能引发广泛且独特的细胞进程变化，特别是诱导了一种伪应激反应，其转录组、蛋白质组及代谢组层面的影响远超氧化态前体，为NAD+补充策略的优化与潜在风险评估提供了重要见解。
1 引言
烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)是细胞代谢的核心分子，既作为氧化还原辅因子，又是多种调控酶（如去乙酰化酶SIRTs、聚ADP核糖聚合酶PARPs）的限速底物。其水平随年龄增长而下降，与多种衰老相关疾病密切相关。因此，补充NAD+前体被视为对抗衰老特征和年龄相关病症的潜在策略。然而，经典的NR和NMN在临床转化中效果有限，部分原因在于其提升NAD+的能力有限（约两倍）以及在胃肠道和循环系统中的不稳定性。
近年来，NR和NMN的还原形式——NRH和NMNH作为新型NAD+前体受到关注。它们在细胞内不依赖于NR激酶(NRKs)，而是通过腺苷激酶磷酸化途径转化为NAD+，展现出更强的NAD+提升能力。但目前对这些还原态前体的全面生物学效应，尤其是与氧化态前体的系统比较仍属空白。
本研究旨在通过对鼠肝细胞(AML12)进行RNA测序、蛋白质组学和代谢组学分析，系统比较NR、NMN、NRH和NMNH这四种NAD+前体在急性暴露条件下的下游转录组、蛋白质组和代谢谱影响。
2 材料与方法
实验使用AML12小鼠肝细胞，在500 μM浓度下分别用NMN、NR、NMNH、NRH或载体(PBS)处理24小时后，分别提取DNA、RNA、代谢物或蛋白质进行分析。
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转录组学：通过Illumina平台进行RNA测序，数据经FastQC、Trimmomatic和HISAT2等工具进行质量控制、修剪和比对，使用edgeR和limma/voom R包进行差异表达分析。
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代谢组学：采用超高效液相色谱-高分辨率质谱联用技术(UHPLC-MS)对胞内代谢物进行分析，通过edgeR和limma/voom进行统计分析。
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蛋白质组学：基于质谱的蛋白质组学分析使用DIA-PASEF模式进行，数据通过DIA-NN处理，并使用MaxLFQ进行归一化，同样采用edgeR和limma/voom进行差异丰度分析。
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胞浆线粒体DNA测定：通过洋地黄皂苷裂解法分离细胞浆组分，并使用qPCR测定胞浆线粒体DNA含量，以阿霉素处理组作为阳性对照。
3 结果
3.1 还原态NAD+前体是NAD+代谢组的强效增强剂
与先前研究一致，还原态前体(NRH和NMNH)引起的NAD+水平提升远超氧化态前体(NR和NMN)。对所有前体处理后NAD+代谢相关通路的分析显示，NRH和NMNH能显著增加NADH水平，而NR或NMN则不能。此外，NRH或NMNH处理能显著提高NAD+消耗酶（如PARPs）的反应产物ADP-核糖水平，而所有处理组的另一个反应产物烟酰胺(NAM)均增加。尽管还原态前体最初生成NADH，然后被细胞脱氢酶氧化为NAD+，与氧化态前体的直接路径不同，但所有前体处理后细胞的NAD+/NADH以及NADP+/NADPH氧化还原态比值均有相似程度的适度增加，表明细胞对氧化还原态存在精密调控。
3.2 还原态NAD+前体引发强烈但不同的代谢反应
对137个检测到的代谢物进行主成分分析显示，NMNH和NRH处理组在代谢物组成上与载体组明显分离，而NMN和NR组则更接近载体组。在统计上显著改变的代谢物数量上，NMN和NR仅影响8个，而NMNH和NRH则分别影响了31个和55个代谢物，表明还原态前体对代谢组的影响更为深远。
进一步分析发现，不同处理组共同影响的代谢物非常有限。只有与NAD+相关的代谢物在所有前体处理后都显著增加。NMNH和NRH共同提升的代谢物包括核苷酸相关代谢物，如ADP-核糖、FAICAR、尿苷和CDP-胆碱。值得注意的是，NRH处理会特异性降低与能量代谢相关的代谢物，如糖酵解中间体葡萄糖-6-磷酸、三羧酸循环中间体顺乌头酸和α-酮戊二酸，以及ATP，这表明NRH可能抑制能量代谢。
3.3 还原态NAD+前体引发的转录组变化远超NAD+相关基因
转录组分析的结果与代谢组类似，主成分分析显示还原态与氧化态前体的基因表达谱显著分离。以p值0.01为阈值，NR和NMN分别引起146和318个基因差异表达，而NMNH和NRH则分别引起了2406和5118个基因的差异表达，数量级远超氧化态前体。
基因表达变化的成对相关性分析显示，氧化态前体之间(NMN与NR)以及还原态前体之间(NMNH与NRH)的基因表达变化模式最为相似。对四种前体共同调控基因的分析发现，仅有22个基因在所有处理中均发生改变，且没有一个与NAD+代谢直接相关，这表明还原态前体影响的细胞通路范围更广。
3.4 还原态NAD+前体上调谷胱甘肽S-转移酶而不影响谷胱甘肽水平
对NMNH和NRH共有的差异表达基因进行基因本体富集分析发现，“谷胱甘肽代谢过程”这一通路显著富集，主要由编码谷胱甘肽S-转移酶(GSTs)的基因驱动。GSTs是参与外源性物质（异生物质）解毒的II相代谢酶家族。
在蛋白质组层面也观察到了与转录组一致的结果。还原态前体引发了比氧化态形式更多的蛋白质水平变化。在检测到的12种GSTs中，有8种在NMNH、NRH或两者处理后均显著上调。然而，尽管GSTs在转录和蛋白水平均被上调，但在大多数情况下，并未观察到还原型谷胱甘肽(GSH)或氧化型谷胱甘肽(GSSG)的耗竭。事实上，NRH处理反而导致GSH和GSSG均显著增加，同时其前体谷氨酸和甘氨酸的丰度下降。
鉴于还原态前体引发的应激相关反应，研究进一步检查了其是否导致线粒体DNA泄露。使用阿霉素作为阳性对照，未观察到任何NAD+前体处理会增加胞浆线粒体DNA水平，这表明尽管触发了应激相关信号，但NMNH和NRH并未引起可检测的线粒体基因组不稳定性。
综上所述，这些结果表明，还原态NAD+前体在没有实际细胞应激源的情况下，诱发了一种细胞“伪应激”反应。因此，没有外源性物质可供谷胱甘肽结合，从而避免了谷胱甘肽的耗竭。
4 讨论
本研究证实了还原态NAD+前体(NRH/NMNH)在提升NAD+代谢组方面比氧化态前体(NR/NMN)更有效。一个有趣的现象是，还原态前体处理也导致其氧化态对应物(NR和NMN)水平显著升高，这可能与细胞内NAD+水平过高时发生的逆向转化有关。
还原态前体引发了远比氧化态前体广泛的转录组变化，这可能反映了在代谢层面观察到的更深刻变化。特别是NRH处理导致糖酵解和三羧酸循环中间体的减少，这暗示了显著的代谢重构。先前研究报道，急性NRH暴露24小时会导致基础呼吸、ATP产生和非线粒体呼吸的降低，与本研究的发现一致。
值得注意的是，对还原态NAD+前体的响应引发了一种伪应激反应，表现为II相解毒酶家族GSTs的上调，但并未引起谷胱甘肽或氧化型谷胱甘肽的耗竭。这提出了一个重要问题：还原态NAD+前体引发的细胞效应是否比其氧化态对应物具有更优越的治疗潜力，或者其益险比可能偏向不利结果？有研究显示，NRH在低至100 μM的浓度下即可在HepG3细胞中诱导剂量依赖性的细胞毒性反应，但在HEK293T细胞中并未导致类似应激。尽管本研究发现了氧化还原应激的转录和蛋白质组学迹象，但并未观察到谷胱甘肽水平的类似变化。这种差异可能与细胞类型、处理时间以及细胞自身的代谢缓冲能力有关。
尽管还原态NAD+前体能更有效地提高NAD+水平，但其更强的代谢影响也可能增加代谢应激的风险。有观点认为，NAD+的快速积累可能通过伴随的还原当量(NAD(P)H)增加而短暂影响氧化还原平衡，最终触发还原性和/或氧化应激。同时，部分应激相关反应可能反映了兴奋效应（即低剂量有益，高剂量有害的激素效应）而非毒性，特别是考虑到本研究未观察到线粒体DNA泄露。总之，这凸显了还原态NAD+前体的卓越效力在体内可能并不统一，组织特异性的代谢能力将很可能决定其最终带来的是益处还是危害。
本研究的一个局限性在于仅依赖于单一种类（AML12细胞系）的体外实验条件，这限制了研究结果的普适性。此外，所用DMEM培养基的营养成分也可能影响基础代谢状态。尽管如此，本研究结果强调了NAD+前体补充策略的复杂性。总而言之，这项研究提供了NAD+前体在培养肝细胞中作用的首个全面比较分析，突出了它们依赖前体类型的转录组、蛋白质组和代谢效应。未来的研究需要在体内和不同细胞类型中探索这些差异，以优化针对代谢性和年龄相关性疾病的NAD+恢复策略。
