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本研究首次揭示了RUNX2在哮喘气道重塑中的关键作用，发现其在患者气道平滑肌（ASM）中表达下调，导致TGF-β1/SMAD3信号通路失调及CTGF等重塑标志物异常表达。通过功能恢复实验，证明RUNX2能有效抑制ASM细胞肥大、增殖及细胞外基质（ECM）产生。这为理解哮喘病理机制提供了新视角，并提示恢复RUNX2功能可能是治疗气道重塑的潜在新策略。
引言：哮喘与气道重塑的挑战
哮喘是一种复杂的多因素疾病，其特征是气道炎症和结构改变。这些结构变化，称为气道重塑，包括气道平滑肌（ASM）体积增加、上皮下和ASM相关的细胞外基质（ECM）改变、新生血管形成和粘液分泌过多。当前的哮喘疗法，包括吸入性皮质类固醇（ICS）和长效β2受体激动剂（LABA），虽然对大多数患者的症状控制有效，但似乎无法影响气道重塑。这突显了深入了解其潜在机制的紧迫性。
转化生长因子-β1（TGF-β1）是气道重塑的关键调控因子，其在哮喘患者肺部的基因和蛋白水平均升高。TGF-β1的许多效应是通过结缔组织生长因子（CTGF）介导的，其在哮喘ASM中的释放增强。
Runt相关转录因子2（RUNX2）是TGF-β1的重要调控元件之一。RUNX2不仅是骨骼形成和成骨细胞分化的关键转录因子，还参与癌症进展。RUNX2基因通过两个替代启动子和外显子7的替代剪接，产生具有不同生物学功能的各种亚型。含有外显子7的RUNX2亚型能够转运到细胞核，并在其他系统中抑制SMAD3介导的TGF-β1诱导的基因转录，包括抑制CTGF表达。然而，迄今为止，RUNX2在哮喘中的表达和生物活性尚未被研究。
材料与方法：多技术手段揭示RUNX2角色
本研究采用多种技术手段，旨在全面阐明RUNX2在哮喘中的作用。首先，通过生物信息学分析，在CTGF基因的肺特异性调控区域发现了多个RUNX家族转录因子的假定结合位点，这提示了RUNX蛋白与TGF-β1信号传导的潜在关联。
研究团队从非哮喘和哮喘受试者的肺组织或支气管活检中分离培养了原代人ASM细胞。通过微阵列分析、实时逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）和蛋白质印迹法检测了RUNX2的mRNA和蛋白表达水平。免疫组化用于鉴定哮喘患者和非哮喘受试者肺组织中的RUNX2蛋白。此外，研究还利用RNA测序技术分析了来自哮喘和健康受试者支气管活检中RUNX2的选择性剪接形式。
在功能研究方面，将不同的RUNX2亚型转染到永生化哮喘ASM细胞中，并测量了炎症和气道重塑的标志物。同时，通过细胞分馏和免疫荧光技术，研究了TGF-β1刺激下RUNX2和SMAD3的亚细胞定位变化。
结果：RUNX2在哮喘ASM中表达失调
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RUNX2丰度降低：与非哮喘ASM细胞相比，来自哮喘受试者的分离ASM细胞中RUNX2的丰度降低。在哮喘和非哮喘患者的肺组织切片中，气道周围的ASM层RUNX2蛋白检测呈异质性模式。
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对TGF-β1的反应异常：TGF-β1刺激增加了非哮喘ASM细胞中RUNX2/RUNX2变体1的mRNA，但在哮喘ASM细胞中没有此效应。这促进了哮喘ASM细胞中SMAD3的活化和核转位。换句话说，在健康细胞中，TGF-β1会诱导RUNX2表达增加，这可能是为了反馈性抑制过度激活的TGF-β1信号；但在哮喘细胞中，这种诱导机制失灵了。
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亚型特异性调控：RUNX2有多种亚型，主要差异在于是否包含外显子7。研究发现在基础状态下，非哮喘和哮喘ASM细胞中带有（V1）和不带外显子7（V2）的RUNX2亚型表达比例相似。然而，TGF-β1选择性地增加了非哮喘ASM中V1和V2亚型的丰度，但在哮喘ASM中无此作用。启动子使用情况在两组细胞间无差异，表明哮喘中RUNX2诱导减少并非由启动子使用偏倚造成。
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亚细胞定位差异：在非哮喘ASM细胞中，RUNX2的V1亚型（60kDa）主要位于细胞质，而V1L亚型（75 kDa）则完全位于细胞核。然而，在哮喘ASM细胞中，V1和V1L的定位发生了反转。TGF-β1处理后，SMAD3向细胞核的转位在哮喘ASM细胞中比在非哮喘ASM细胞中更显著。尽管TGF-β1处理并未显著改变RUNX2亚型向核内转位的量，但核内V1L+ V1（即含有外显子7的“活性”亚型）的总和在非哮喘ASM细胞中更高。
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RUNX2恢复实验抑制重塑标志物：在永生化哮喘ASM细胞中过表达RUNX2亚型，未能改变炎症标志物（如IL-6）的水平，但显著降低了重塑标志物（CTGF）、ASM细胞肥大标志物（GSK-3β和Desmin）和增殖标志物（pSer795Rb和α-微管蛋白）。具体而言，RUNX2-V1和RUNX2-V2过表达在12小时抑制了TGF-β1诱导的CTGF mRNA水平，而所有三种亚型（V1L、V1和V2）均能在蛋白水平抑制CTGF。此外，所有RUNX2亚型的过表达都削弱了GSK-3β在Ser9位点的磷酸化（意味着GSK-3β活性增强），减少了Desmin表达，并降低了pSer795Rb和α-微管蛋白水平，这表明RUNX2能抑制ASM细胞的肥大和增殖进程。
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哮喘患者中RUNX2剪接增加：在支气管活检中，哮喘患者与非哮喘受试者相比，RUNX2的总mRNA丰度无差异。然而，哮喘患者中RUNX2 mRNA的选择性剪接程度更高。发现了多种新的剪接事件，其中Δ外显子5和Δ外显子7变体较为常见。尽管这些变体的频率在组间无显著差异，但内含子6-7和内含子6-7剪接事件在哮喘气道中更常见，而内含子6*-8剪接变体在健康气道中更常见。这些剪接变化可能影响RUNX2蛋白的稳定性和功能。
讨论：RUNX2在气道稳态中的潜在关键作用
本研究首次阐明了RUNX2在哮喘病理生物学中的调控和功能。RUNX2在气道组织中的蛋白检测具有高度变异性，但揭示了哮喘气道细胞中RUNX2基因表达较低，并且这种缺陷放大了TGF-β1诱导的哮喘ASM细胞中的SMAD3反应。RUNX2变体减弱了TGF-β1诱导的CTGF表达以及哮喘ASM中的肥大/增殖反应标志物，提示其在气道稳态中扮演角色。
特定RUNX2亚型的缺失可能是导致哮喘气道稳态丧失、进而促进重塑的基本事件。TGF-β1刺激仅增加了非哮喘ASM细胞中的RUNX2转录本水平。哮喘活检中RUNX2大量未经证实的替代剪接事件，引发了这些新变体在疾病中作用的疑问，其后果之一可能是蛋白质不稳定。这可以解释当主要E3连接酶（WWP1）在哮喘ASM中同时减少时，RUNX2蛋白的下降。
通过恢复实验探索RUNX2缺失在哮喘中的致病作用，发现在研究的变体中，只有V1抑制了TGF-β1诱导的CTGF mRNA水平，这与在人主动脉血管平滑肌细胞（HASMCs）中的其他研究一致。这一发现表明RUNX2-V1可能在哮喘中很重要，因为CTGF与哮喘患者基底膜厚度相关。GSK-3β和Desmin的激活是细胞生长的重要调节因子，两者在过敏性气道疾病模型中均升高，并与不良临床结果相关。所有RUNX2变体（与CTGF不同）对这些通路的抑制进一步证明了RUNX2在维持气道稳态中的作用。
RUNX2的三种主要亚型（V1、V1L和V2）在非哮喘和哮喘ASM细胞之间似乎存在差异。迄今为止的所有研究都强调外显子7对RUNX2功能性的必要性；令人困惑的是，含有外显子7的亚型（V1和V1L）的核定位在非哮喘和哮喘ASM细胞之间存在差异。在TGF-β1刺激后，非哮喘ASM细胞核部分中V1L和V1（被认为在RUNX2功能效应中具有“活性”作用）的含量高于哮喘ASM细胞。这些数据表明外显子7含有的变体之间存在一定程度的功能冗余。V1L中N端延伸在调节亚细胞定位中的作用尚未得到充分探索。然而，这不太可能是由于诱导了抑制剂（如MSX2），因为它们在非哮喘和哮喘ASM细胞之间没有变化。相反，V2在两种细胞类型中主要位于细胞质，证实了外显子7在促进核-质穿梭中的重要性。
RUNX2亚型的DNA结合能力似乎并不影响ASM肥大/增生的调控。经典的TGF-β1信号传导涉及SMAD的磷酸化和核转位，它们与靶基因中的SMAD结合元件（SBE）结合并介导转录。RUNX2转位的动力学与TGF-β1处理后的SMAD3不相关，使得两者的直接相互作用不太可能。HASMCs中的一项研究也显示，RUNX2通过RUNX2-P300/CBP（环AMP反应元件结合蛋白[CBP]）或HDAC复合物间接抑制SMAD3。最近的一项研究表明，TGF-β1通过蛋白激酶A（PKA）促进RUNX2转位，而TGF-β1的激活是SMAD依赖性的。因此，逆转ASM肥大/增生的机制很可能是通过与辅因子（如HDAC）的相互作用实现的，在我们的系统中，这些因子在非哮喘和哮喘ASM细胞之间没有变化，并且似乎不受外显子7存在的影响。
对人类肺组织的检查显示，RUNX2在上皮细胞层中丰富，在ASM细胞中较少，这与最近一项关于特发性肺纤维化（IPF）的研究一致。在该研究中，RUNX2在IPF肺的多种细胞类型中表达，包括纤维化肺泡II型（ATII）细胞中的强信号，而在肌成纤维细胞中表达较少。敲低RUNX2减少了促纤维化的ATII增殖和迁移，但增加了成纤维细胞中的ECM表达，这表明RUNX2在两种细胞类型中的作用相反。另一项最近的研究显示，与对照组患者相比，哮喘患者支气管刷检物中的RUNX2转录本增加，并且上皮RUNX2表达与诱导痰中的嗜酸性粒细胞呈正相关。然而，正常气道和非哮喘ASM细胞维持较高的RUNX2水平，这表明RUNX2抑制健康气道ASM中的细胞生长和肥大，其缺失可能反映了驱动哮喘发病机制的促成性变化。这在脉管系统中有所反映，其中血管SMC中增强的RUNX2负向调节CTGF表达，抑制内皮细胞生长并诱导其凋亡。可用于研究RUNX2蛋白表达的工具无法识别组织中的RUNX2变体，因此本研究中在哮喘气道中检测到的RUNX2蛋白可能是缺乏功能性外显子7的V2形式。
结论与展望
本研究首次表明，TGF-β1选择性地仅增加非哮喘ASM细胞中的RUNX2，而不增加哮喘ASM细胞中的RUNX2。哮喘ASM中RUNX2的丧失放大了TGF-β1诱导的促重塑反应，而恢复RUNX2表达可以抑制这些过程，特别是通过V1亚型抑制CTGF。此外，哮喘患者气道中RUNX2的剪接事件更为频繁，可能进一步导致其功能失调。这些发现确立了RUNX2在维持气道稳态中的关键作用，其功能紊乱是哮喘气道重塑的重要机制。因此，通过RUNX2抑制CTGF表达可能为未来哮喘治疗提供新的机会。
