《FEBS Open Bio》：Exon 7 splicing of ERα predicts poor prognosis and increases phenotypic heterogeneity in luminal a subtype breast cancer
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本文综述了ERαΔ7（ERα剪接变异体）在乳腺癌Luminal A亚型中的功能与临床意义。研究通过TCGA数据分析发现，ERαΔ7高表达与患者不良预后相关。在细胞模型中，ERαΔ7+细胞表现出更强的生存能力，但增殖和迁移减缓，并且仍保留对雌激素剥夺的敏感性。分子动力学模拟证实雌二醇仍可结合ERαΔ7。该研究提示ERαΔ7可作为Luminal A型乳腺癌潜在的预后标志物，其表达增加了肿瘤表型异质性。
背景
雌激素受体（ER）在大约70%的乳腺癌中表达，既是致癌驱动因子也是治疗靶点。人ESR1基因转录本由八个外显子组成，可通过可变剪接产生ERα的剪接变异体，为ERα的功能引入了额外的多样性。ERαΔ7是乳腺癌中最常观察到的剪接变异体之一，其跳过了外显子7，导致移码和随后的截短，产生一个较短的466个氨基酸的蛋白质（51 kDa）。其丢失的C端区域包含AF-2反式激活结构域、配体结合域（LBD）的一部分以及ERα-ERα二聚化界面。尽管在患者组织中其表达量约为经典ERα的1%，但其功能在很大程度上仍然未知。
结果
1. TCGA分析揭示ERαΔ7在Luminal A乳腺癌中的预后价值
研究分析了来自TCGA数据库的112例正常乳腺组织和510例乳腺癌样本中ESR1外显子7的Percent-Spliced In（PSI）值，以评估ERαΔ7的表达。PSI值接近1表示外显子7完全包含（ERαΔ7低），而较低的值则表明外显子跳过（ERαΔ7高）。密度图显示，在正常组织、基底样和HER2富集亚型中，PSI值接近1，表明ERαΔ7表达极少。相比之下，超过一半的Luminal A和Luminal B肿瘤的PSI值低于1，中位值分别为0.983和0.977，表明ERαΔ7表达相对升高。
生存分析显示，在Luminal A患者中，较低的PSI（较高的ERαΔ7）与较差的总生存期显著相关（P= 0.013），而在Luminal B型中未观察到。将ERαΔ7 PSI作为连续预测因子的单变量Cox分析得出的风险比（HR）为0.71。此外，PSI值与ESR1mRNA水平在Luminal A和B亚型中呈负相关，暗示ERαΔ7表达增加可能抑制ESR1转录，可能作为一种显性负性变异体发挥作用。这些结果表明，ERαΔ7表达（以外显子7 PSI值衡量）可作为Luminal A乳腺癌的重要预后标志物。
2. ERαΔ7+MCF-7细胞表现出不同的表型特征
为研究其细胞功能，研究建立了CRISPR/Cas9工程化的MCF-7模型，内源性表达ERαΔ7。通过将带有StrepII标签的截短外显子8插入到内源ESR1基因的外显子6末端，产生了两个克隆：ESR1Δ7 (1) 和 (2)。同时构建了表达全长ERα的ESR1-full细胞系和ESR1-KO细胞系作为对照。Western blot和基因组PCR证实了ERαΔ7/ERα的表达和插入。
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集落形成与生存： 在生理浓度雌二醇下，ESR1Δ7 (1) 和 (2) 的集落面积小于野生型、ESR1-full和ESR1-KO细胞系，表明其生长延迟。生存实验显示，ESR1Δ7 (1) 和 (2) 的细胞死亡率（0.1-0.5%）显著低于野生型和ESR1-full细胞（0.5-1.5%），表明ERαΔ7+细胞具有增强的生存能力。
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细胞增殖： CCK-8实验显示，在4天内，野生型和ESR1-full细胞数量翻倍，而两个ESR1Δ7细胞系仅增加了不到1.5倍。EdU掺入实验进一步表明，ERαΔ7+细胞进入S期的细胞数量持续比ESR1-full和ESR1-KO细胞少10-20%，表明其DNA复制活性降低，生长速度较慢。
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细胞迁移： 伤口愈合实验表明，ESR1Δ7 (1) 和 (2) 细胞在伤口创建6小时后才开始迁移，但在12-24小时时间范围内的迁移速率与野生型和ESR1-full细胞系相当，表明ERαΔ7表达可能影响细胞可塑性。
3. ERαΔ7+MCF-7细胞对雌激素剥夺有反应
尽管ERαΔ7的配体结合口袋和AF-2结构域不完整，但研究意外地发现，在生存和增殖实验中，ERαΔ7+MCF-7细胞仍对雌激素剥夺有反应。完全去除雌二醇使细胞死亡增加三倍，而他莫昔芬的添加使死亡增加约30%。在增殖实验中，用1 μM他莫昔芬预处理1小时导致S期进入减少，其程度与野生型和ESR1-full细胞系相似。
4. 分子动力学模拟显示雌二醇可与ERαΔ7结合
为探究其分子机制，研究进行了雌二醇与ERαΔ7或ERα配体结合域结合的全原子分子动力学（MD）模拟。使用Alphafold2预测的ERαΔ7结构，并根据已发表的雌二醇结合ERα的晶体结构（PDB: 1A52）进行对接。在50 ns的模拟中，雌二醇在ERαΔ7和ERα口袋中停留的时间相似，表明雌二醇-ERαΔ7结合并未被废除。MM-PBSA计算的结合自由能（ΔG）显示，ERαΔ7的结合能比ERα平均低1.7 kcal·mol-1，但仍保持在-20至-30 kcal·mol-1的强结合范围内。Autodock Vina对接分析也报告了2.0 kcal·mol-1的结合能降低，与MM-PBSA结果比例相当。这些数据表明，ERαΔ7仍可螯合雌二醇，这可能部分解释了ERαΔ7表达细胞对雌二醇的敏感性。
讨论
本研究表明，ERαΔ7 PSI与Luminal A乳腺癌患者的总生存期相关，并提供了超越临床协变量和ESR1表达的增量预后信息。在细胞模型中，ERαΔ7+细胞在ER+背景下表现出增强的生存能力，但以增殖减少为代价。重要的是，ERαΔ7+和ESR1-KO MCF-7细胞表现出不同的表型，表明ERαΔ7剪接不同于ER-乳腺癌。由于ERαΔ7剪接不是基因组过程，其水平可能被精细调控、可逆，并且在同一个肿瘤内因适应微环境而存在时空差异，这使得肿瘤细胞可以在高增殖的ERα表型和高生存的ERαΔ7表型之间进行选择。ERαΔ7相关的生存优势可能解释了乳腺癌不良预后和高复发率，因为表达更多ERαΔ7的细胞有助于在体内更持久地存在。
此外，ERαΔ7表达与ESR1基因表达呈负相关，这可能进一步促进了ERαΔ7表型的出现。关于其作用机制，可能与同样缺乏C端结构域的ERα36类似，通过非基因组信号通路（如与Akt/PI3K和MAPK/ERK通路相互作用）来促进细胞生存，同时下调增殖基因表达。最后，研究数据表明，ERαΔ7表达本身并不赋予内分泌治疗耐药性。在保留内源性ERα背景的MCF-7细胞中，ERαΔ7仍表现出雌激素反应性，这提示其功能具有上下文特异性，可能主要通过非基因组途径发挥作用，而MCF-7细胞可能提供了启用此类信号传导的额外上位性因子。分子动力学模拟证实ERαΔ7仍可螯合雌二醇，未来研究需要进一步明确ERαΔ7在这种非基因组背景下的任何调节或协同作用。总之，这项研究强调了ERαΔ7作为Luminal A型乳腺癌潜在预后标志物的重要性，并揭示了其通过增加表型异质性影响肿瘤行为的复杂功能。
