《Journal of Cellular and Molecular Medicine》：Systematic Identification and Functional Validation of CASP10 as a DNA-Damage-Responsive Driver of Endothelial Pyroptosis in Atherosclerosis
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本研究通过系统生信分析与实验验证，首次将caspase-10 (CASP10)确立为动脉粥样硬化(AS)中连接DNA损伤应答(DDR)与内皮细胞焦亡的关键节点。研究发现，CASP10不仅是区分斑块稳定性的高精度生物标志物(AUC>0.99)，更是ox-LDL诱导下内皮细胞DNA损伤(γH2AX积累)及焦亡(NLRP3/GSDMD-N/IL-1β激活)的必要与充分条件。靶向CASP10有望成为稳定斑块、治疗AS的新策略。
摘要
动脉粥样硬化(AS)是一种由内皮功能障碍和斑块不稳定性驱动的慢性炎症性疾病。DNA损伤应答(DDR)与内皮细胞命运相关，但其在AS中的确切作用尚不清楚。本研究旨在鉴定与AS相关的DDR相关生物标志物，并阐明其在内皮细胞焦亡中的作用机制。分析确定了66个DDR相关基因，这些基因在外部数据集中区分早期与晚期病变、出血性与非出血性斑块的准确率超过80%，在区分斑块稳定性方面达到100%准确率。与其他DDR基因相比，CASP10成为顶级的诊断生物标志物(AUC = 0.991)。单细胞分析证实了AS斑块内皮细胞中CASP10的表达升高。功能实验揭示，CASP10对于ox-LDL诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)DNA损伤和焦亡既是必要的也是充分的。CASP10过表达加剧了γH2AX积累、NLRP3表达、GSDMD-N裂解和IL-1β释放，而CASP10敲低则减弱了这些效应。总之，CASP10是识别不稳定斑块的可靠生物标志物，并作为连接DNA损伤与内皮细胞焦亡的关键介质。靶向CASP10可能代表一种减少内皮细胞死亡和稳定动脉粥样硬化斑块的新型治疗策略。
1 引言
动脉粥样硬化(AS)是一种以脂质积累和内皮功能障碍为特征的慢性炎症性疾病，是缺血性心脏病的主要病理生理学基础。缺血性心脏病的主要并发症是心肌梗死，其由供应心肌的冠状动脉突然闭塞引起，是全球范围内导致死亡的主要原因。冠状动脉闭塞的主要原因（75%的病例）是斑块破裂和血栓形成，两者都指示晚期动脉粥样硬化。尽管研究广泛，但动脉粥样硬化斑块进展的精确分子机制仍不清楚。内皮细胞作为血管系统与下方组织之间的界面，通过调节血管张力以及发挥抗血栓和抗炎作用，在维持血管稳态中扮演关键角色。内皮功能障碍是斑块形成、进展和不稳定的关键因素，会引发血管炎症。然而，内皮功能障碍的机制复杂，需要进一步阐明。因此，持续需要识别新的生物标志物，为动脉粥样硬化斑块患者的风险分层和新治疗策略的开发提供基础。
双链断裂、氧化碱基加合物和端粒损耗汇聚于经典的DNA损伤应答(DDR)网络，该网络主要由共济失调毛细血管扩张症突变(ATM)/共济失调毛细血管扩张症和Rad3相关(ATR)-p53轴以及聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)协调。ATM或ATR募集到损伤位点启动了组蛋白H2AX的局部磷酸化，这是DDR启动的关键事件。这种进化上保守的途径可以感知DNA损伤，并通过激活称为DDR的信号级联将信息传递至整个细胞。该应答有两个不同但协调的功能：它可以防止或抑制受损DNA复制和分布到子细胞，从而防止遗传错误的扩散；它还协调细胞内的努力以修复DNA损伤并维持基因组完整性。如果增殖细胞中的DNA损伤能够及时正确地修复，细胞将迅速恢复正常增殖。相反，当DNA损伤特别严重时，细胞可能启动细胞衰老过程，这是由DNA修复信号通路触发的自然不可逆的细胞周期停滞。然而，也可能出现另一种结果，即细胞可能发生程序性细胞死亡，主要通过凋亡进行，这是一种细胞自杀形式，可以将受损细胞从细胞群体中移除。这个过程对于防止具有不可修复DNA损伤的细胞增殖和维持组织稳态至关重要。越来越多的证据表明，持续的内皮DNA损伤不仅是斑块负担的被动关联，而且是早期、因果性的触发因素，通过驱动适应不良的炎症反应和结构失稳来加速动脉粥样硬化发生。虽然内皮DNA损伤已被因果性地牵涉到动脉粥样硬化斑块的起始和进展中，但反映基因毒性应激驱动的促炎症和斑块失稳反应的生物标志物在很大程度上仍未得到探索。
焦亡是一种caspase-1/4/5/11依赖性的、高度炎症性且广泛传播的程序性裂解细胞死亡形式。激活后，NLRP3聚合成大分子支架，募集衔接蛋白ASC（含CARD的凋亡相关斑点样蛋白）和pro-caspase-1。NLRP3的N端pyrin结构域驱动pro-caspase-1的邻近诱导自蛋白水解，产生具有催化活性的p20/p10四聚体。活化的caspase-1随后切割gasdermin-D，释放成孔N端片段(GSDMD-N)，并同时将pro-interleukin-1β转化为成熟的IL-1β。孔插入和膜破裂将GSDMD-N和IL-1β释放到细胞外空间，放大细胞因子回路，募集巨噬细胞并扩大坏死核心。我们先前证明ox-LDL触发强烈的内皮细胞焦亡并加速动脉粥样硬化斑块形成，而独立研究同时报道了ox-LDL刺激的HUVECs中显著的DNA损伤灶。然而，在动脉粥样硬化中机制性连接基因毒性应激与内皮细胞焦亡的特定DDR效应基因在很大程度上仍然不清楚。
传统的DDR代理——p53、γH2AX和PARP1——不足以解码人动脉粥样硬化内皮的多样性炎症景观。利用高分辨率转录组，我们探究了整个DDR模块以寻找调节焦亡的基因。通过整合颈动脉斑块的bulk RNA-seq和内皮单细胞RNA-seq数据，我们部署了一个集成机器学习框架来推导全基因组的DDR特征，其中caspase-10 (CASP10)浮现为主导驱动因子，能有效区分动脉粥样硬化斑块的性质。CASP10表达在ox-LDL刺激的内皮细胞中显著上调，并且是放大DNA损伤(γH2AX)和触发焦亡所必需的。shRNA介导的CASP10敲低在体外显著减弱了DNA损伤诱导的焦亡。总体而言，我们的数据确立了CASP10作为一个数据定义的治疗节点，用于靶向AS中的DDR-焦亡轴。
2 材料与方法
研究采用了六个动脉粥样硬化微阵列数据集（GSE100927, GSE43292, GSE28829, GSE120521, GSE163154和GSE159677）。GSE100927被指定为训练集，GSE43292用作验证集，其余数据集用于进一步验证。从GeneCards数据库鉴定了4529个与DNA损伤应答(DDR)相关的基因。使用“limma”包进行差异分析。通过多种方法进行功能富集分析。使用“ConsensusClusterPlus”包进行共识聚类分析以根据DDR相关差异表达基因(DEGs)的表达模式对患者进行分类。应用四种机器学习方法（LASSO回归、支持向量机递归特征消除(SVM-RFE)、LightGBM和神经网络(NNET)）来识别动脉粥样硬化中的DNA损伤相关特征。通过维恩图确定四种分类模型之间的重叠枢纽基因。构建了列线图来量化机器学习衍生的基因特征对动脉粥样硬化的诊断价值。分析了单细胞RNA测序(scRNA-seq)数据集GSE159677以描绘在动脉粥样硬化中表达关键生物标志物的细胞群体。进行了相关分析以评估CASP10与已知焦亡相关基因之间的关联。进行了分子对接模拟以研究CASP10与IL-1β和NLRP3之间的相互作用。从人脐带分离原代人脐静脉内皮细胞(HUVECs)并进行培养，用氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)处理以诱导CASP10。使用慢病毒转导和基于质粒的方法在体外调节基因表达。通过定量实时PCR(qRT-PCR)、免疫荧光(IF)分析和蛋白质印迹(Western Blotting)评估基因和蛋白表达。使用R和GraphPad Prism进行统计分析。
3 结果
3.1 DDR相关DEGs的鉴定和功能富集分析
在数据集GSE100927中，共鉴定出646个DEGs，包括360个上调基因和286个下调基因。在数据集GSE43292中，表现出1279个DEGs。通过维恩分析交集这两个数据集的DEGs，鉴定出133个上调和90个下调的AS相关基因。进一步与DDR相关基因集交集，鉴定出66个DDR相关的DEGs。后续的GO和KEGG富集分析表明，这些基因显著富集于多种生物过程，包括免疫反应分子介质的产生、核质运输、焦亡、DNA结合转录因子结合、模式识别受体活性、蛋白质-脂质复合物、NOD样受体信号通路和炎症反应。
3.2 DDR相关DEGs作为区分AS斑块类型的差异标志物
使用66个DDR相关的DEGs对三个数据集（GSE28829、GSE120521和GSE163154）中不同类型的AS斑块进行聚类分析。在GSE120521数据集中，DDR相关的DEGs有效区分了稳定与不稳定斑块（100% vs. 100%）。在GSE28829数据集中，早期斑块主要聚集在簇1（92%），而晚期斑块主要聚集在簇2（81%）。在GSE163154数据集中，簇1中的大多数AS样本被表征为斑块内出血(IPH)动脉粥样硬化（23/27, 85%），簇2中的绝大多数样本被识别为非IPH动脉粥样硬化（15/16, 94%）。这些结果表明，DDR相关的DEGs可以准确区分AS斑块的阶段以及稳定性特征。
3.3 关键DDR基因的鉴定和AS诊断模型的构建
使用GSE100927作为训练集和GSE43292作为验证集，对四种机器学习框架进行了基准测试：LASSO保留了前13个预测因子（AUC = 0.998/0.859），SVM-RFE识别了20个诊断基因（AUC = 1.000/0.857），LightGBM-SHAP与SHAP算法结合排定了前30个重要特征的重要性（1.000/0.757），神经网络分析通过所有基因的综合权重计算建立了诊断基因重要性层次（1.000/0.738）。对排定的基因列表进行维恩交集，产生了一个最小、稳健的特征，包含三个高重要性基因：CASP10、CD36和SMARCA1。基于这些基因，使用GSE100927数据集开发了AS的诊断列线图。校准曲线、决策曲线分析(DCA)和临床影响曲线证实了优异的拟合度和净收益。在GSE100927上构建并在GSE43292中验证的预测模型实现了0.991的综合AUC，超过了个体基因的表现。此外，在三个独立的外部队列（GSE120521、GSE28829、GSE163154）中，三基因特征准确区分了稳定与不稳定斑块（AUC = 1.00）、早期与晚期斑块（AUC = 0.947）以及出血性与非出血性斑块（AUC = 0.942）。
3.4 核内皮CASP10驱动oxLDL诱导的早期AS中的DNA损伤
来自人颈动脉斑块和邻近正常动脉的35,784个细胞的单细胞RNA-seq解析出16个簇，分为八种细胞类型；内皮细胞(ECs)显示出较高的CASP10表达水平，其次是血管平滑肌细胞(VSMCs)、巨噬细胞、B细胞、自然杀伤(NK)细胞、成纤维细胞、中性粒细胞和T细胞。为测试ECs CASP10是否参与动脉粥样硬化的起始，将HUVECs暴露于ox-LDL。研究发现，ox-LDL以浓度和时间依赖性方式显著上调CASP10的表达。基于这些结果，选择100 μg/mL ox-LDL浓度和24小时孵育期作为最佳实验条件。蛋白质印迹和荧光显微镜分析显示，caspase 10表达在ox-LDL刺激的HUVECs中上调，且caspase 10主要定位于细胞核。为了进一步探索CASP10的功能作用，在HUVECs中创建了CASP10敲低和过表达模型。γH2AX是DNA损伤的高度敏感标志物。值得注意的是，与仅ox-LDL处理组相比，pcDNA-CASP10显著提高了ox-LDL处理的HUVECs中γH2AX的表达，而靶向CASP10的shRNA(shCASP10)即使在ox-LDL诱导下也抑制了γH2AX的表达。这些发现共同表明，CASP10的上调增强了ox-LDL诱导的内皮细胞DNA损伤，突出了其在动脉粥样硬化早期阶段的作用。
3.5 CASP10表达与AS中焦亡相关基因的相关性分析
先前的研究证实了ox-LDL诱导的HUVECs焦亡在AS中的作用。在此基础上，对224个动脉粥样硬化相关DEGs和先前研究中使用的52个已知焦亡基因进行了维恩分析，识别出四个共有基因：NLRP3、IL18、IL1β和NOD2。与正常动脉组织相比，这四个基因的表达水平在GSE100927数据集的AS斑块中显著增加。为了进一步阐明这些基因与CASP10之间的关系，使用Sangerbox平台和GEPIA进行了共表达分析，重点关注主动脉和冠状动脉组织。这项综合分析显示，只有NLRP3和IL1β与CASP10 consistently显示出显著的正相关（p < 0.05）。
3.6 CASP10调节ox-LDL诱导的HUVECs焦亡
首先确认了HUVECs中焦亡相关分子的表达。与先前研究一致，NLRP3和IL1β在ox-LDL处理的HUVECs中上调。此外，GSDMD-N和caspase 1-P20的表达也增加。进一步，分子对接模拟揭示CASP10以空间定义的方式与NLRP3和IL1B特异性相互作用。具体而言，CASP10的残基136-166形成了一个对于NLRP3结合至关重要的关键基序，而残基189-190和330-495可能代表了靶向IL-1β的关键结构决定因素。pcDNA-CASP10显著提高了先前由ox-LDL诱导的HUVECs中焦亡相关分子的表达水平。相反，shCASP10显著降低了HUVECs中焦亡相关分子的表达水平，即使在ox-LDL诱导下也是如此。这些发现共同表明，CASP10的上调增强了ox-LDL诱导的内皮细胞焦亡，而CASP10敲低显著减轻了这种效应。
4 讨论
动脉粥样硬化现在被广泛认为是一种由慢性内皮损伤和适应不良的炎症反应驱动的疾病。本研究利用多转录组数据、机器学习生物标志物发现和严格的功能验证，将CASP10鉴定为一个先前未被充分探索的DDR相关生物标志物，它将基因毒性应激与内皮细胞焦亡联系起来。这些发现通过将CASP10定位在血管DDR和炎症小体激活的交汇点，扩展了当前对动脉粥样硬化发病机制的理解。
最初对三个独立转录组数据集的整合分析，识别出66个与DDR相关的差异表达基因。这些基因的转录特征有效区分了稳定与不稳定斑块、早期与晚期病变以及出血性与非出血性斑块。这种跨队列的一致性突出了基因集的广泛适用性，并支持其作为斑块易损性的分子分类器的潜力。值得注意的是，无监督聚类在三个外部数据集中达到了超过80%的准确率，在区分斑块稳定性方面达到完美准确率（100%）。虽然该队列的样本量适中可能影响这些结果，但DDR相关基因在表征动脉粥样硬化斑块的风险分层方面表现出色，表明DDR特征可以增强当前的风险分层算法。
为了进一步识别与AS相关的关键DDR相关基因，采用了结合LASSO、SVM-RFE、LightGBM-SHAP和神经网络分析的综合方法，最终确定了三个高度可靠的诊断基因：CASP10、CD36和SMARCA1。这三个基因的组合对AS表现出卓越的诊断性能（AUC = 0.991），在区分三种类型AS斑块方面优于先前识别的66个DDR相关基因（AUC > 0.94）。关于CD36与AS关联的研究非常丰富。然而，通过验证集的ROC曲线分析，发现CD36的诊断价值相对较低，AUC曲线下面积仅为0.864。尽管SMARCA1具有最高的诊断价值，但实验验证揭示了ox-LDL诱导的HUVECs中SMARCA1的表达与AS相应转录组数据之间存在差异。鉴于其诊断效力、在内皮基因毒性反应中的独特作用以及在ox-LDL刺激的HUVECs中一致的转录和翻译谱，CASP10被优先考虑用于进一步研究。
CASP10是位于人类染色体位点2q33-34的caspase家族成员，与CASP8具有高度同源性。它对于细胞生存至关重要，通过与RIP、NIK和IKKα相互作用促进NF-κB激活，并参与非凋亡或抗凋亡信号通路。近年来，CASP10在肿瘤中的作用被广泛报道。此外，CASP10上调可以通过诱导心肌细胞凋亡来驱动扩张型心肌病的进展。这些研究突出了CASP10在多种疾病中的参与，但其在动脉粥样硬化发病机制中的作用仍未得到探索。颈动脉斑块的单细胞分析证实了AS斑块内皮细胞中CASP10的表达升高，与转录组数据一致，并提供了空间分辨率。这种在内皮细胞中的选择性富集可能反映了它们作为暴露于循环ox-LDL的第一血管层的位置，使其成为基因毒性应激的主要传感器。HUVECs中的功能实验表明，CASP10对于ox-LDL诱导的HUVECs的DNA损伤和焦亡既是必要的也是充分的。
某些病毒感染或紫外线损伤可导致疾病过程中核膜完整性的破坏，导致双链DNA释放到细胞质中，随后激活NLRP3。然而，AS是一种非传染性低度炎症性疾病，表明NLRP3炎症小体激活可能存在不同的机制。NLRP3炎症小体的激活最终导致成熟IL-1β的表达和分泌到细胞外环境，体现了经典的焦亡途径。NLRP3炎症小体的异常激活与小鼠和人类的动脉粥样硬化进展有关。胆固醇晶体激活NLRP3炎症小体，导致内皮细胞中促炎细胞因子IL-1β和IL-1α的产生。这种激活将胆固醇与无菌炎症联系起来，这是动脉粥样硬化的一个关键特征。循环IL-1β和IL-18水平升高与巨噬细胞募集增加、加速泡沫细胞形成和斑块进展有关。在ApoE缺陷小鼠和人类中的研究表明，IL-1β抑制可降低动脉粥样硬化风险，突出了IL-1β作为病变进展的核心驱动因素。然而，中和或抑制外源性IL-1β并不能解决其持续产生的问题。因此，直接靶向NLRP3炎症小体产生的IL-1β可能比仅仅中和或抑制外源性IL-1β提供更有效的治疗策略，因为它解决了这种细胞因子的持续产生。先前的实验已经证实，针对内皮细胞焦亡的干预措施可以减少内皮NLRP3和IL-1β表达，
