《Journal of Integrative Plant Biology》：lincRNA6679 promotes FnPR1B expression via phosphorylation-activated FnWRKY14 to enhance strawberry resistance to Botrytis cinerea
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本綜述聚焦於揭示植物（尤其是草莓）抵抗灰黴病菌（Botrytis cinerea）的一種新型分子調控機制。研究團隊通過 lncRNA 測序鑑定出關鍵的長鏈非編碼 RNA lincRNA6679，發現其通過招募轉錄因子 FnWRKY50 或 FnMYB59，以順式調控方式正向調控其靶基因 FnWRKY14 的表達。隨後，FnWRKY14 進一步被 MAPK 級聯通路（FnMAPKK4–FnMAPK3/6）磷酸化激活，進而上調下游抗病基因 FnPR1B 的表達，最終增強了草莓對灰黴病的系統性抗性。該工作首次系統解析了 lncRNA 在草莓抗病中的功能，為深入理解植物-病原互作的非編碼 RNA 調控網絡提供了新視角，也為草莓抗病分子育種提供了潛在的新靶點。
研究背景
灰黴病（Botrytis cinerea）是一種由死體營養型真菌引起的毀滅性病害，在全球範圍內嚴重威脅包括草莓在內的多種經濟作物的生產。植物的天然免疫系統，如病原相關分子模式觸發的免疫（PTI），是對抗這類病原的關鍵。然而，灰黴病的致病機制複雜，其背後的分子調控網絡，特別是非編碼 RNA 在其中的作用，仍有待深入闡明。長鏈非編碼 RNA（long non-coding RNA， lncRNA）作為長度超過 200 個核苷酸、基本不具備蛋白質編碼能力的轉錄本，在植物生長發育及逆境響應中扮演重要角色，但其在植物抗病，尤其是草莓抗灰黴病中的功能和機制研究尚不充分。草莓作為全球廣泛種植的小漿果，灰黴病是其生產中最具破壞性的病害之一，常導致 20%–30% 的產量損失，嚴重時超過 50%，對產業發展構成嚴重阻礙。目前，針對草莓灰黴病的分子研究主要集中在編碼基因，如多個 WRKY 轉錄因子的功能驗證，但對非編碼基因，特別是與抗病相關的 lncRNA 的研究仍然有限。因此，深入探索草莓抵抗灰黴病的分子機制，特別是 lncRNA 的調控作用，對於豐富植物抗病理論、指導抗病育種具有重要意義。
不同草莓資源對灰黴病菌的抗性鑑定
研究首先對 18 種不同草莓種質資源進行了灰黴病抗性篩選。通過組織分離法從田間感染的草莓中分離出灰黴病菌活體孢子，並將孢子濃度調整至 1×105孢子/毫升後，對離體葉片進行接種。結果顯示，在接種後 4 天，不同資源間表現出不同程度的抗性。其中，黃毛草莓（Fragaria nilgerrensis）、智利草莓（Fragaria chiloensis）和麝香草莓（Fragaria moschata）表現出較強的抗性，而白果型錫金草莓（Fragaria nubicola, White-fruit type）和弗吉尼亞草莓（Fragaria virginiana）則表現出較弱的抗性。至接種後 6 天，白果型錫金草莓、細弱草莓（Fragaria gracilis）和弗吉尼亞草莓的葉片幾乎完全被病原菌感染。台盼藍染色結果進一步證實了這一趨勢，抗病品種的葉片染色程度明顯低於感病品種。根據病情指數分析，細弱草莓、弗吉尼亞草莓和白果型錫金草莓的病情指數較高，分別為 75、70 和 66，屬於高度感病；而智利草莓、黃毛草莓和麝香草莓的病情指數較低，分別為 25、33 和 37，被歸類為高抗類型。此外，測量接種後抗病與感病草莓葉片中超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）的活性，以及丙二醛（MDA）、過氧化氫（H2O2）和葉綠素的含量發現，抗氧化酶活性在處理後 2–4 天普遍達到峰值，且抗病草莓中的水平顯著高於感病草莓。H2O2和 MDA 含量在處理期間呈上升趨勢，感病草莓中的含量顯著高於抗病草莓。所有草莓的葉綠素含量均下降，其中感病草莓下降更為明顯。這些結果綜合表明，黃毛草莓相較於白果型錫金草莓具有更強的抗病性。
抗灰黴病相關 lncRNA 的篩選與鑑定
為了鑑定與灰黴病抗性相關的 lncRNA，研究團隊對高抗的黃毛草莓和高感的白果型錫金草莓（二者均為二倍體且結白色果實）在接種後 0 天和 4 天的葉片進行了 lncRNA 測序。共鑑定出 7,281 個 lncRNA，其中基因間 lncRNA（lincRNA）佔大多數（80.61%），其餘為內含子 lncRNA（7.92%）、反義 lncRNA（6.25%）和正義 lncRNA（5.22%）。在黃毛草莓中，220 個差異表達的 lncRNA 裡有 196 個通過順式（cis）機制調控靶基因；而在白果型錫金草莓中，73 個差異表達 lncRNA 中有 64 個通過順式機制調控靶基因。兩者中超過 99% 的靶基因均由 lncRNA 順式調控。京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析顯示，兩組差異表達基因中最顯著富集的通路均為“植物-病原體互作”，其次為“植物激素信號轉導”通路。基於這些發現，研究選取了黃毛草莓中參與抗病通路的 lncRNA 及其靶基因進行後續研究。
lincRNA6679 增強草莓對灰黴病菌的抗性
lncRNA 測序分析揭示了一個基因間 lncRNA——lincRNA6679（MSTRG.6679.1），其在抗病的黃毛草莓中顯著上調，而在感病的白果型錫金草莓中未見顯著變化。通過 5' 和 3' RACE 實驗，確定了 lincRNA6679 的全長轉錄本為 754 bp。利用 CPC 網站評估其編碼潛能，結果表明 lincRNA6679 不具備蛋白質編碼潛力，儘管其含有一個 17 個氨基酸的開放閱讀框（ORF）。為了驗證其 ORF 活性，將 ORF-GFP 融合構建體在本氏煙草葉片中進行瞬時表達，但未檢測到 GFP 信號。進一步在 lincRNA6679 的 5' 端添加“ATG”、“ATGG”和“ATGGG”序列，並在 3' 端連接 GFP 編碼序列後進行表達和蛋白質免疫印跡分析，結果顯示 GFP 蛋白的分子量在所有三種 ORF 構建體中保持一致，排除了 lincRNA6679 與 GFP 之間存在連續 ORF 的可能性，從而確認 lincRNA6679 是 lncRNA 而非編碼 RNA。
2O2含量及 SOD 酶活性測定。">
通過農桿菌介導的穩定遺傳轉化，獲得了 lincRNA6679 的過表達和沉默轉基因草莓株系。接種灰黴病菌並進行 NBT 和 DAB 染色後發現，過表達 lincRNA6679 增強了草莓葉片對灰黴病的抗性，而沉默 lincRNA6679 則顯著降低了抗性。病斑大小和酶活性的變化也證實了 lincRNA6679 正向調控對灰黴病的抗性。為了闡明 lincRNA6679 及其潛在 ORF 在草莓果實中的抗病功能，將 lincRNA6679 過表達、其 ORF 過表達、修飾後 ORF 過表達以及沉默載體導入草莓果實。表型觀察發現，lincRNA6679 通過非編碼機制而非其 ORF 的蛋白編碼功能來增強草莓果實的抗病性。定量 RT-PCR 驗證和酶活性測定進一步確認了這一結論。這些結果共同證明 lincRNA6679 正向調控草莓對灰黴病的抗性。
lincRNA6679 招募轉錄因子 FnWRKY50 或 FnMYB59 正向調控 FnWRKY14 的表達
lncRNA 測序分析顯示，lincRNA6679 的靶基因是 FnWRKY14（FnYN3G009920）。基因組位置分析表明，兩者均位於 2 號染色體上，lincRNA6679 位於 FnWRKY14 的下游，相距超過 10 kb，提示存在順式調控關係。為了闡明 lincRNA6679 如何調控其靶基因 FnWRKY14 的表達，研究進行了 RNA Pull-down 實驗以鑑定與 lincRNA6679 相互作用的蛋白。結果發現，與 lincRNA6679 相互作用的蛋白主要包括 FnWRKY50、FnERF15 和 FnMYB59 等轉錄因子。利用 AlphaFold3 預測了 lincRNA6679 全長序列與篩選蛋白形成的複合物結構。基於預測的結合域，通過 RNA 電泳遷移率變動分析（EMSA）進一步證明了 lincRNA6679 能夠與 FnWRKY50、FnERF15 和 FnMYB59 這三種蛋白相互作用。
對 FnWRKY14 的啟動子序列進行分析後，發現了 WRKY（W-box）、MYB（MRE）和 ERF（GCC-box）的結合位點。酵母單雜交實驗表明，FnWRKY50 和 FnMYB59 能夠結合到 FnWRKY14 的啟動子上。電泳遷移率變動分析證實了這些相互作用。雙螢光素酶報告基因和 β-葡萄糖醛酸酶（GUS）實驗證明，FnWRKY50 和 FnMYB59 正向調控 FnWRKY14 的表達；同時，lincRNA6679 可以增強 FnWRKY50 和 FnMYB59 對 FnWRKY14 的調控效果。因此，研究得出結論：lincRNA6679 通過招募 FnWRKY50 或 FnMYB59 蛋白，形成 RNA-蛋白複合物，結合到 FnWRKY14 的啟動子上，從而正向調控其表達。
FnWRKY14 增強草莓對灰黴病菌的抗性
進一步研究 FnWRKY14 的特性與功能，構建了 FnWRKY14-GFP 融合載體，發現 FnWRKY14 是一個細胞核定位蛋白。通過農桿菌介導的穩定遺傳轉化，獲得了 FnWRKY14 的過表達和沉默轉基因草莓株系。對轉基因株系進行灰黴病菌接種感染實驗及 NBT 和 DAB 染色後發現，過表達 FnWRKY14 增強了草莓對灰黴病的抗性。病斑面積的大小和酶活性的變化進一步證實了 FnWRKY14 正向調控草莓對灰黴病的抗性。
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此外，研究還通過果實瞬時轉化實驗發現，與對照相比，過表達 FnWRKY14 的果實中 FnWRKY14 表達量顯著升高，感染症狀較輕；而沉默 FnWRKY14 的果實則表達量顯著降低，病害症狀更為嚴重。接種前後果實酶活性測量也顯示，過表達 FnWRKY14 的果實 SOD 水平顯著上升，H2O2含量下降，而沉默株系的變化趨勢相反。這些結果表明 FnWRKY14 正向調控草莓對灰黴病的抗性。
FnWRKY14 正向調控 FnPR1B 表達以提高草莓對灰黴病菌的抗性
lncRNA 測序分析顯示，FnWRKY14 富集於 KEGG 抗病通路，而 PR1 是該通路中 WRKY 的下游靶基因。由於 PR1 是水楊酸（SA）介導的防禦反應的標誌基因，可能具有廣譜抗病功能，研究首先檢測了 SA 處理後黃毛草莓中 lincRNA6679 和 FnWRKY14 的表達水平，發現兩者均被 SA 顯著上調。在黃毛草莓基因組中鑑定出 10 個 FnPR1s 基因，RT-qPCR 檢測發現其中 7 個 FnPR1s 基因在接種後表達顯著上調。分析這 7 個基因的啟動子序列，發現它們都含有 WRKY 結合位點。
研究克隆了這 7 個 FnPR1s 基因的啟動子並構建重組載體。酵母單雜交實驗揭示，FnWRKY14 僅與 FnPR1B 的啟動子結合。電泳遷移率變動分析證明 FnWRKY14 能夠結合到 FnPR1B 啟動子的 W-box（TTGACT）結合位點。雙螢光素酶報告基因實驗顯示，共轉染 pRI101-FnWRKY14 和 proFnPR1B::LUC 的本氏煙草葉片中觀察到最高的 LUC 螢光，實驗組的 LUC/REN 螢光活性是對照組的 4.9 倍，存在顯著差異，表明 FnWRKY14 正向調控 FnPR1B 的表達。
為了進一步驗證 lincRNA6679、FnWRKY14 和 FnPR1B 之間的調控效應，將 lincRNA6679-AN、FnWRKY14-AN 和 proFnPR1B::GUS 共轉入草莓果實。結果顯示，lincRNA6679 增強了 FnWRKY14 對 FnPR1B 表達的調控作用。此外，在草莓植株中過表達 lincRNA6679 增強了 FnWRKY14 的表達，而沉默 lincRNA6679 則降低了其表達。過表達 FnWRKY14 也增強了 FnPR1B 的表達，沉默 FnWRKY14 則降低了其表達。為了驗證 FnPR1B 的功能，構建了 FnPR1B 的擬南芥過表達株系。接種灰黴病菌後發現，FnPR1B 增強了擬南芥葉片對灰黴病的抗性。綜上所述，FnWRKY14 通過結合 FnPR1B 啟動子，正向調控該抗病基因的表達，從而增強草莓對灰黴病的抗性。
MAPK 信號通路磷酸化 FnWRKY14 增強其對 FnPR1B 表達的調控並進一步提高草莓抗病性
考慮到 MAPK 信號級聯在植物免疫中的重要作用，研究推測 FnWRKY14 可能受到 MAPK 的調控。首先測試了 FnWRKY14 是否具有自激活活性，結果表明其不具備自激活能力。通過與擬南芥 AtMAPKs 進行序列比對，並在草莓數據庫中篩選，鑑定出 11 個 FnMAPKs。酵母雙雜交實驗表明，FnMAPK3 和 FnMAPK6 與 FnWRKY14 存在相互作用。Pull-down 實驗進一步在體外證實了 FnMAPK3/6 與 FnWRKY14 的相互作用，其中 FnMAPK6 的互作效應更為明顯。雙分子螢光互補（BiFC）和免疫共沉澱（Co-IP）實驗證明了 FnMAPK3/6 與 FnWRKY14 在體內存在相互作用。
接著，研究探究了 FnMAPK3/6 是否磷酸化 FnWRKY14。使用純化的 FnWRKY14-His、FnMAPK3/6-GST 和 FnMAPKK4DD-GST 融合蛋白進行了體外磷酸化實驗。結果顯示，只有當 FnWRKY14 與 FnMAPK3/6 以及 FnMAPKK4DD 共同孵育時，才能檢測到 FnWRKY14 的磷酸化形式。利用液相色譜-串聯質譜（LC-MS/MS）鑑定了體外激酶實驗中的磷酸化肽段，分析發現了四個高置信度的磷酸化位點：Ser210 和 Thr288 被 FnMAPK3 磷酸化，而 Ser210 和 Ser262 被 FnMAPK6 磷酸化。
為確定 FnWRKY14 的轉錄活性是否受其磷酸化狀態調控，進行了 GUS 轉錄活性實驗。將 proFnPR1B::GUS 與 FnMAPK3、FnMAPK6 和 FnWRKY14 混合後注射到草莓果實中。結果顯示，FnWRKY14 以依賴於 FnMAPK3 或 FnMAPK6 的方式激活並顯著增強了 GUS 的轉錄。然而，FnWRKY14S210A、FnWRKY14T288A和 FnWRKY14S262A突變體則消除了對 proFnPR1B::GUS 報告基因的激活。這些數據表明，FnMAPKK4–FnMAPK3/6 模塊通過在不同磷酸化位點對 FnWRKY14 進行磷酸化，對其轉錄激活功能起到至關重要的正向調控作用。
總結
本研究通過 lncRNA 測序、遺傳轉化和分子互作實驗，系統闡明了 lincRNA6679 通過招募 FnMYB59 或 FnWRKY50 蛋白形成複合物，進而促進 FnWRKY14 表達的分子機制。FnWRKY14 作為一個關鍵的轉錄因子，能夠結合到下游抗病基因 FnPR1B 的啟動子上，正向調控其表達。同時，FnWRKY14 的轉錄活性受到 FnMAPKK4–FnMAPK3/6 信號模塊的磷酸化修飾調控，從而進一步放大其對抗病防禦的增強作用。這項研究首次在草莓中系統解析了一個 lncRNA 在抗病中的功能，揭示了一個涉及轉錄調控和磷酸化事件的、先前未知的分子通路，拓寬了對植物-病原體互作中非編碼 RNA 調控網絡的理解，並為旨在提高抗病性的草莓分子育種提供了可操作的靶點。
