从多细胞性回归单细胞性：Pseudanabaenales目（蓝藻门）中两个新球状属（新属Portococcus与Pseudanabaenococcus）的描述及其对早期多细胞性演化研究的启示
《Journal of Phycology》：To multicellularity and back again: Description of two new coccoid genera (Portococcus gen. nov. and Pseudanabaenococcus gen. nov.) in the basal “filamentous” order Pseudanabaenales, Cyanobacteria
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本篇研究通过对蓝藻类群Pseudanabaenales（伪项圈藻目）进行多相分类学分析，结合全基因组测序，揭示了一个单细胞谱系在该类群中的单系起源。研究新描述了Portococcus与Pseudanabaenococcus两个新属，共包含五个新种，证实了在这些发明了丝状体的早期蓝藻演化支系中存在多细胞性的丧失。这一发现不仅揭示了该类群的隐蔽多样性，更为研究原核生物早期多细胞性的遗传与生理机制提供了理想的模型。
引言
分子生物学和全基因组测序技术的进步极大地增强了我们对蓝藻系统发育分类学的理解，促成了对深部分支谱系（如Pseudanabaenales目）的重新定义。Pseudanabaenales目在生态分布上非常广泛，从淡水到咸水，从热带到极地均有发现，但其形态多样性一度被认为相对有限。Pseudanabaenales的一个显著特征是其藻丝中细胞数量的高度可变性，许多菌株表现出短藻丝性（brevitrichomy），即藻丝短且细胞数量较少。这表明其细胞间连接可能是一种相对原始的多细胞形式，Pseudanabaenales很可能代表了蓝藻中最早出现的多细胞性实例。然而，短链与真正的丝状体之间的界限常常模糊，这给区分球状和丝状形态带来了挑战，也突显了结合形态、遗传和生态数据的综合方法对于蓝藻分类的重要性。本研究旨在通过识别和分类描述Pseudanabaenales中明确为单细胞类型的菌株，结合新获得的全基因组数据，深入理解该类群中单细胞与多细胞形式之间的进化路径，为未来研究早期多细胞性的功能奠定基础。
材料与方法
研究使用的单藻蓝藻菌株从自然环境样本中分离获得，并在实验室条件下进行长期培养。通过光镜（LM）和透射电镜（TEM）对所有菌株的形态和超微结构进行观察和记录。从培养菌株中提取总基因组DNA，扩增并测序包含部分16S rRNA基因和16S–23S ITS（内部转录间隔区）rRNA区的rRNA操纵子片段。对新菌株进行全基因组测序，并使用生物信息学工具对测序数据进行组装、分箱和质量评估。基于16S rRNA基因序列和由120个保守细菌标记蛋白串联组成的多基因座数据集，分别构建系统发育树（采用贝叶斯推断和最大似然法），以确定新分类单元的系统发育位置。对ITS rRNA区进行二级结构分析，以识别潜在的属级或种级结构特征。此外，利用平均核苷酸一致性（ANI）、平均氨基酸一致性（AAI）和数字化DNA:DNA杂交（dDDH）等基因组比较方法，评估新菌株之间的遗传关系。研究遵循了基于DNA序列数据的既定分类阈值（如16S rRNA基因相似性<94.5%可视为不同属，ITS rRNA区差异>7%可作为物种分离的强证据）来进行分类学决策。
结果
分类学描述
研究基于多相分类学证据，在Pseudanabaenales目下的Pseudanabaenaceae科中，正式描述了两个新的单细胞蓝藻属：Portococcus属和Pseudanabaenococcus属。
Portococcus属的诊断特征包括：形态上难以与Synechococcus等类群区分，但其在多基因座系统发育树上构成Pseudanabaenaceae科内的一个单系群。其分子结构上的共有衍征包括：在16S–23S ITS rRNA区存在一个pre-tRNA螺旋，两个tRNA基因之间缺乏V2螺旋，以及具有一个异常长的D5螺旋。细胞为单生或分裂前成对存在，呈卵圆形或圆柱形，长度大于宽度，通过垂直于细胞长轴的二分裂繁殖，不形成分裂后的细胞链。类囊体多为周生。多发现于温带地区的淡水或亚气生（石生）环境。
该属描述了四个新种：
- 1.
Portococcus lusitanicus：模式种，分离自葡萄牙山区溪流的静水池。细胞平均较宽（2.7 μm），长度与宽度比相对较低，分裂末期子细胞常呈半球形。具有严格的周生类囊体。
- 2.
Portococcus limneticus：分离自德国后采矿湖泊。细胞平均比其他三种更细长（平均长4.6 μm），始终保持长大于宽。ITS rRNA结构最接近P. sanctae-mariae，但在Box-B和V3螺旋结构上存在差异。
- 3.
Portococcus sanctae-mariae：分离自奥地利高山石灰岩洞穴湿润岩石表面的附石生物膜。为亚气生，形成大型粘液状菌落，具深棕色色素。类囊体从周生到辐射状排列。
- 4.
Portococcus stanieri：模式菌株为著名的PCC 6802（原被归为Synechococcus或Pseudanabaena）。细胞明显更长更窄（平均长5.7 μm，宽1.7 μm），长宽比可达5:1。在分子水平上，其V3螺旋明显更长。
Pseudanabaenococcus属的诊断特征包括：形态上与Synechococcus和Portococcus难以区分，但在系统发育上构成了Pseudanabaenales目内一个深度分离的谱系。其ITS rRNA二级结构与Portococcus不同，具有V2螺旋但缺乏pre-tRNA螺旋；与Pseudanabaena和Thalassoporum不同，其ITS rRNA区末端具有分支，同时产生V3和D5螺旋。此外，其5S rRNA分子5‘端以5’-GCUU-3‘起始，这与大多数蓝藻（5’-UCCU-3‘）不同。基因组数据显示，该属模式菌株PCC 7502的基因组大小和GC含量显著低于Pseudanabaenales目中的邻近属。
该属描述了单一新种：Pseudanabaenococcus habilitatus。模式菌株为SAG 2387，分离自德国高地淡水溪流的钙华生物膜。细胞单生或呈不规则聚集，圆柱形，长大于宽，具有薄而无色的鞘。类囊体周生。
系统发育与生物信息学分析
多基因座和16S rRNA基因系统发育树在属级水平上得出了几乎一致的菌株分组，但在更深节点上拓扑结构有所不同。全基因组系统发育树清晰地支持了Thalassoporaceae科和Pseudanabaenaceae科的分离，而16S rRNA基因树在科及以上层级大多缺乏统计学支持。
在对应于Pseudanabaenaceae科的进化支内，除了明确属于Pseudanabaena属各种的大型进化支外，还解析出另外三个独立的进化支。其中一支由单菌株LEGE 16661代表，对应于最近描述的Tumidithrix属。更靠近根部，但在Pseudanabaenaceae科内，推断出两个完全由球状菌株组成的独特进化支。采样更充分的属级进化支被描述为Portococcus属，包含四个非丝状菌株。第二个进化支包含SAG 2387和PCC 7502菌株，被正式描述为Pseudanabaenococcus属。这两个新球状属的谱系在16S rRNA基因树中也得到了支持，并且与邻近类群的16S rRNA基因距离大于5%，这进一步支持了它们作为独立属的地位。
基因组比较（ANI， AAI， dDDH）结果符合既定的物种和属的划分阈值，进一步证实了四个Portococcus物种以及Portococcus与Pseudanabaenococcus作为不同属的分类地位。
结论
本研究成功地将Pseudanabaenales目中的一个突出的未定义单细胞谱系解析为一个单系群，并基于综合的多相分类学方法（包括全基因组系统发育、ITS rRNA区二级结构分析、形态学、超微结构及生态数据），正式描述了Portococcus和Pseudanabaenococcus两个新属及其包含的五个新种。这些分类单元的建立，澄清了先前在“Synechococcus”和“Pseudanabaena”名下存在的隐蔽多样性。
研究最重要的发现是，这些单细胞类群在系统发育上嵌套在原本为丝状体的Pseudanabaenales目（特别是Pseudanabaenaceae科）内部。这表明，在蓝藻进化史上最早发明丝状体（多细胞性）的类群中，发生了多细胞性的次级丧失（从多细胞性“回归”到单细胞性）。这一现象为研究原核生物早期多细胞性的遗传基础、生理机制及其可逆性提供了一个独特而宝贵的模型系统。
此外，来自不同地理区域多种淡水栖息地和一个陆地洞穴栖息地的新分类单元记录表明，在这些深部分支的进化支中，仍存在大量有待发现的隐蔽多样性。本研究也强调了全基因组系统发育分析对于准确评估蓝藻属间和科间系统发育关系至关重要，建议将其作为蓝藻多相分类学中新的标准整合进来。未来的研究可以在此基础上，深入探索驱动这种形态转变（多细胞性的获得与丧失）的具体基因和调控网络。
