《Exploration》：Autologous Extracellular Matrix-Based Cell-Free Therapy for Tissue Regeneration Through Trem2+ Macrophages Mediated Angiogenesis
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本研究介绍了一种创新的自体细胞外基质（ECM）膜（脂肪源基质膜，ADF），其制备灵感源于传统“造纸术”，为组织再生提供了无细胞疗法新策略。ADF具备良好的生物活性与机械强度，可长期低温保存建立“ECM库”。该研究揭示了Trem2+巨噬细胞通过促进血管生成在ADF介导的软组织修复中的关键作用，为再生医学机制与应用提供了新视角。
1 引言
细胞外基质（ECM）是一个动态的结构与功能蛋白网络，不仅提供结构支架，还调节细胞行为和组织稳态。脱细胞ECM生物膜已成为有前景的再生医学支架，来源包括人皮肤、猪真皮、牛心包和猪肠黏膜下层，具有优异的生物相容性和可编程的降解特性，广泛应用于乳房重建、伤口愈合、牙周再生和整形外科等领域。然而，异种或同种异体来源的材料仍面临免疫相容性、结构保真度和患者特异性定制等挑战。
自体ECM作为理想的再生材料，具备完美的生物相容性、无排斥风险以及患者特异性的生物活性成分。其中，自体脂肪源ECM（Extracellular Matrix）结合了四大关键优势：通过抽脂技术可获取高产率且供区发病率低；其多孔结构组织易于温和脱细胞；富含脂肪因子和干细胞因子等治疗性生物分子；以及在多个外科领域具有已证实的临床疗效。其固有的生物活性在促进组织再生和整合方面显著优于其他来源，而其卓越的软组织相容性使其成为从乳房重建到体积增容等应用的理想选择。尽管机械强度欠佳是目前的一个显著限制，但这一挑战需要通过不断改进加工方法来增强结构完整性和提高批次间一致性。
受古老造纸艺术的启发，本研究开发了一种源自脂肪组织的自体ECM生物膜，称为脂肪源基质膜（ADF， Adipose-derived Matrix Film）。其制备采用简单的物理方法，能高效去除脂质和细胞核，同时保留ECM的生物活性。ADF表现出组织再生所需的最佳机械性能，且生产高效，利于临床转化。更重要的是，ADF可在低温下长期保存，从而能够建立用于个性化医疗的“ECM库”。作为一种无细胞疗法，ADF能增强软组织再生和伤口愈合。值得注意的是，在组织再生和伤口愈合过程中观察到丰富的Trem2+巨噬细胞激活，提示TREM2（Triggering Receptor Expressed on Myeloid cells 2）信号与ADF驱动的血管生成之间存在潜在的机制联系。单细胞分析和实验表明，Trem2+巨噬细胞通过血管内皮生长因子（VEGF， Vascular Endothelial Growth Factor）介导的血管内皮细胞激活来驱动血管生成，而成纤维细胞来源的纤连蛋白1（FN1， Fibronectin 1）信号调节其再生功能。这些发现确立了Trem2+巨噬细胞作为脂肪ECM诱导的组织再生的关键介质，为再生医学提供了新的机制见解。
2 结果
2.1 ADF的制备与表征
ADF的基本制备方法模仿“造纸”步骤：获取富含纤维的自体脂肪组织；通过连续粉碎和洗涤进行脱细胞以去除脂质、血液成分和细胞碎片，同时保留天然ECM结构；机械压制形成生物膜。
组织学分析证实了ADF能有效去除细胞核（残留核仅5.73 ± 0.87%）和脂质（残留脂质降至初始水平的1.35 ± 0.55%），同时保持了ECM的完整性。傅里叶变换红外光谱（FT-IR）分析揭示了处理各阶段样品的分子特征谱，表明ADF保留了特征性的ECM蛋白峰（如酰胺I带、酰胺II带），而脂质信号极微。拉伸测试显示，ADF在室温下表现出典型的J形应力-应变曲线，拉伸强度为383.35 ± 16.41 kPa，拉伸应变为5.36 ± 0.52%，虽然略低于商业脱细胞真皮基质（ADM， Acellular Dermal Matrix），但仍表现出良好的机械特性。ADF在弯曲、扭转等操作下保持结构完整，展现出优异的可塑性和机械回弹性。
扫描电子显微镜（SEM）观察显示，ADF表面具有由压制过程中网状约束形成的均匀凸起和凹陷，有利于生物膜与组织的附着、接触以及组织液的早期浸润。激光共聚焦显微镜显示，与ADM相比，ADF和冻存ADF（F-ADF）在绿光激发下均呈现粗糙但均匀的表面形态。溶胀行为评估表明，ADF、F-ADF和ADM在生理盐水中均在24小时内达到溶胀平衡，且溶胀率极低，表明其抗溶胀性，适合植入后稳定组织和维持形状体积。在胶原酶I处理下的降解评估显示，ADF和F-ADF的降解速率无显著差异，表明冷冻保存并未显著改变ADF对胶原酶的敏感性。
2.2 ADF的体外生物相容性与体内安全性评估
通过活/死细胞活力测定评估了ADF和F-ADF对四种临床相关细胞类型（角质形成细胞HaCat、脂肪来源干细胞ADSCs、人脐静脉内皮细胞HUVEC、人真皮成纤维细胞HDF）的细胞毒性。结果显示，两者均表现出优异的生物相容性，细胞存活率均大于95%，细胞毒性小于3%，且F-ADF在延长储存后仍保持了生物相容性。溶血实验表明，ADF和F-ADF的溶血率均低于5%（分别为1.63 ± 1.41%和1.88 ± 1.35%），符合ISO 10993-4:2017标准，证明了其血液相容性。
通过植入小鼠后12周对主要器官（心、肝、脾、肺、肾）的组织学和免疫组化分析进行了全面的系统生物相容性评价。宏观观察无异常，苏木精-伊红（HE）染色显示所有实验组组织架构保留，无病理改变。定量评估显示所有组细胞凋亡极少，生理性的CD68+巨噬细胞浸润处于基线水平，组间无显著差异。血液学、生化和免疫学综合分析显示，所有细胞成分和肝肾功能标志物（ALT、AST、BUN、CRE）均维持在生理范围内，与假手术对照组无显著差异。酶联免疫吸附试验（ELISA）分析显示，ADF组的促炎细胞因子（IL-6、TNF-α、CRP）处于基线水平，与对照组和F-ADF组相当，表明无系统性炎症反应。这些多层次分析为ADF和F-ADF植入物的血液相容性和系统生物相容性提供了有力证据。
2.3 ADF对脂肪间充质干细胞、血管内皮细胞、角质形成细胞和成纤维细胞的功能调控
ADF和F-ADF能显著促进ADSCs的增殖和迁移。EdU标记显示ADF和F-ADF组的增殖率显著高于对照组。CCK-8（Cell Counting Kit-8）检测显示随时间推移增殖增强。Transwell实验显示，两种材料诱导迁移的细胞数是对照组的3倍以上。油红O定量显示，ADF和F-ADF显著增强了ADSCs的脂质积累。在分子水平上，蛋白质印迹和qPCR分析证实，ADF和F-ADF显著上调了关键成脂转录因子过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）和CCAAT/增强子结合蛋白α（C/EBPα）的表达。
ADF和F-ADF通过互补机制促进血管生成。EdU和CCK-8检测显示它们显著增加了HUVEC的增殖。划痕实验显示伤口闭合率更高。最关键的Matrigel管形成实验量化了优异的血管生成能力，ADF和F-ADF产生的总血管长度和连接点形成均显著多于对照组。
此外，ADF和F-ADF还显著增强了关键皮肤细胞群HDF和HaCat的增殖和迁移能力。这些发现表明ADF和F-ADF能同等促进对皮肤再生至关重要的细胞类型的增殖和迁移能力。
2.4 ADF的蛋白质组成与功能分析
蛋白质组学分析揭示了ADF和F-ADF之间显著的组成相似性。主成分分析（PCA）显示两组样本群有大量重叠。相关性分析显示组内和组间均有强相关性。层次聚类热图直观证实了处理组间无显著分离。差异表达分析在检测到的418种蛋白质中仅发现24种（占5.7%）存在显著差异，且包括Col1A1、Col1A2、Col4A1等多种ECM蛋白在内的含量均无统计学差异，表明冷冻保存过程基本保留了天然脂肪源基质的必需蛋白质组成和功能特征。
对ADF中最丰富的100种蛋白质进行功能表征。基因本体（GO）分析显示，ADF相关蛋白显著富集于对组织再生至关重要的关键生物过程，特别是伤口愈合和细胞-基质粘附。这些蛋白主要定位于富含胶原的细胞外基质和细胞-基质连接处。分子功能分析确定了三种关键能力：细胞外基质结合、整合素介导的粘附和细胞骨架肌动蛋白相互作用。京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路分析显示在三个功能相关的通路上有统计学意义的富集：粘着斑、ECM-受体相互作用和氨基酸生物合成。蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络分析确定了几个关键的功能介质，其中纤维连接蛋白1（FN1）作为核心的细胞外基质组织者出现。这些发现共同确立了ADF衍生基质作为功能优化的支架，能够通过ECM结构提供物理支持，通过生长因子 sequestration介导再生信号，并通过细胞-基质反馈环路促进动态相互作用。
2.5 ADF促进组织再生与重塑，同时保持其形态和性能
在小鼠背部皮下植入评估其体内再生性能。ADF和F-ADF在植入后表现出卓越的结构稳定性，原始结构保持完好，变形极小。定量体积测量显示，植入后2周体积显著扩张至原始体积的约139%（ADF）和134%（F-ADF），此后在整个研究期间保持稳定。这种体积稳定性与体外溶胀平衡测量结果密切匹配。
应力-应变分析显示植入后ADF仍具有特征性的J形曲线，极限抗拉强度略有下降，而应变能力有所增加。功能测试证实了其保持的可折叠性和形状记忆特性。
植入的ADF和F-ADF支架的组织学评估揭示了一个组织良好的、时间依赖性的脂肪组织再生过程。HE染色显示，到24周时，组织发育成脂肪组织，占总面积的45.70 ± 14.06%。马松三色染色提供了伴随脂肪生成的细胞外基质重塑过程的关键见解。图像分析量化了脂肪细胞成熟度的不同时间模式：过渡性脂肪细胞（25–50 μm）在12周时占主导，而成熟脂肪细胞（> 50 μm）在24周时成为主要群体。围脂滴蛋白（Perilipin）免疫荧光显示了进行性的脂肪生成。蛋白质印迹和qPCR分析表明，再生的ADF中成脂主调控因子PPARγ和C/EBPα的表达显著上调。细胞因子微环境分析揭示了一个精确计时的炎症阶段及随后的消退过程。这些分子发现为再生组织的成脂定向提供了令人信服的证据。
2.6 细胞浸润介导的血管生在ADF再生与重塑中起关键作用
细胞浸润是组织再生和重塑的主要驱动力。对植入后不同时间点的免疫荧光染色分析显示，细胞浸润具有明显的时空模式：2周时，细胞浸润主要局限于外周区域；随着时间的推移，浸润逐渐向中央区域延伸，到12周时达到均匀分布。定量分析显示ADF和F-ADF组具有可比性的细胞浸润模式。
为了监测这种重塑过程，我们实施了针对小鼠胶原的物种特异性免疫组化，以精确追踪移植物被宿主替代的动态过程。宿主胶原替代从边缘区开始，到24周时达到接近完全的重塑（93.10 ± 3.21%）。这种时空模式与细胞浸润密切相关，证实了宿主细胞介导的功能性支架重塑。
鉴于细胞浸润和血管生成的相互依存关系，我们使用CD31和α-SMA/CD31共染色评估了血管化。新生血管形成反映了浸润动态，从边缘向中央进展。使用光声成像（PAI）进行的3D血管网络分析进一步量化了ADF植入物中卓越的血管生成，与对照组皮肤相比，总血管长度、总血管面积、连接点数量和端点数量均显著增加。这些发现强调了细胞浸润和随之而来的血管生成在ADF介导的组织再生和成功重塑中的关键作用。
综上所述，本研究成功开发了一种新型的自体脂肪源基质膜（ADF），其制备方法简单高效，具备良好的生物相容性、机械性能和长期保存能力。ADF能有效促进包括脂肪生成和血管生成在内的多细胞功能，并引导有序的组织再生与重塑。研究首次揭示了Trem2+巨噬细胞在ADF介导的血管生成和组织再生中的核心作用。这些发现显著推进了无细胞再生医学领域，并为组织修复和血管重建的基本机制提供了新的理解。
