《Infection and Drug Resistance》：Smoking and Clostridioides difficile Colonization in Adults Aged ≥40 Years: Findings from a Community-Based Gut Microbiota Study
编辑推荐：
本研究通过社区横断面调查，揭示了吸烟是台湾南部≥40岁成人社区获得性艰难梭菌(CdC)定植的独立危险因素(aOR 2.35)，其患病率为11.6%。研究通过16S rRNA测序发现，CdC个体的肠道菌群呈现不同特征，如变形菌门(Proteobacteria)相对丰度增加。这提示可改变的生活方式因素（吸烟）可能通过影响肠道微生物组，增加对CdC的易感性，为社区CdC的流行病学提供了新的见解。
引言
艰难梭菌(Clostridioides difficile)是一种革兰氏阳性、厌氧、产孢杆菌，可引起从轻度腹泻到暴发性结肠炎和中毒性巨结肠等一系列胃肠道疾病。艰难梭菌感染已成为全球主要的公共卫生问题，在医疗保健和社区环境中的发病率均呈上升趋势。尽管传统上认为CDI是医疗相关感染，但越来越多的证据表明，无症状艰难梭菌定植在CDI的流行病学中起着关键作用。无症状携带者可能是传播的储存库，并且当宿主防御或肠道菌群完整性被破坏时，后续发生有症状感染的风险会增加。
大多数关于CdC的现有流行病学研究都集中在住院人群，其已知的危险因素包括抗生素暴露、住院、胃酸抑制、管饲和免疫抑制治疗。相比之下，关于社区成年居民中CdC的数据仍然有限，尤其是在台湾的人群中。社区获得性CdC在流行病学上很重要，因为它代表了进入医疗机构的艰难梭菌的潜在上游来源，并且可能与住院患者相比具有不同的风险特征。然而，台湾社区获得性CdC的患病率、危险因素和微生物群特征尚未得到很好的表征。
肠道菌群通过胆汁酸代谢、营养竞争、短链脂肪酸产生和调节宿主免疫反应等机制，在抵抗艰难梭菌的定植中发挥核心作用。肠道微生物生态系统的破坏（即菌群失调）一直与艰难梭菌定植和感染的易感性增加相关。虽然抗生素暴露是菌群失调最公认的驱动因素，但与生活方式相关的因素也可能影响肠道菌群的组成和功能。吸烟已被证明会改变肠道微生物多样性和关键细菌类群的相对丰度，可能会损害定植抗性。流行病学研究报告显示，与不吸烟者相比，吸烟者的CDI发生率更高，但吸烟、肠道菌群改变与社区CdC之间的关联仍然知之甚少。
在台湾，先前关于艰难梭菌的研究主要集中在住院患者、产毒菌株或临床感染结局上，住院人群的定植率各不相同。对台湾患者的肠道微生物群的研究主要针对CDI治疗和微生物群恢复，而不是社区中的无症状定植。迄今为止，在台湾整合流行病学风险因素和肠道微生物群谱的社区CdC数据十分缺乏。因此，我们在台湾南部参与常规健康筛查项目的≥40岁成年人中进行了一项横断面、社区为基础的研究。目的是确定社区获得性CdC的患病率，确定相关的人口统计学和生活方式相关风险因素（特别是吸烟），并利用16S rRNA宏基因组分析探索有CdC和无CdC个体之间的肠道菌群差异。通过整合流行病学和微生物组数据，本研究旨在为导致CdC的潜在生活方式相关途径提供见解，并为未来的纵向和机制研究产生假设。
材料与方法
样本收集、基因组DNA提取和艰难梭菌定植检测
这项横断面研究使用了从台南市政府生物样本库获得的残留粪便DNA样本。总共250份粪便DNA样本来自2006年至2009年间由原台南县政府卫生局在社区健康筛查计划中收集的粪便免疫化学潜血检测标本。这些筛查计划是台湾全国性结直肠癌筛查计划的一部分，目标人群为≥40岁的成年人，其中40-64岁者每三年筛查一次，≥65岁者每年筛查一次。参与筛查计划是自愿的。因此，研究人群可能不能完全代表所有社区成年居民，特别是那些偏好结肠镜等替代筛查方式的人。在解释结果时考虑了这种潜在的选择偏倚。
粪便DNA提取和艰难梭菌定植检测
使用苯酚/氯仿/异戊醇提取法从残留的iFOBT标本中提取粪便DNA。提取的DNA样本在-25°C下长期储存，无需额外的防腐剂，这符合当时生物样本库的标准储存程序。在分析之前，通过琼脂糖凝胶电泳评估DNA完整性。通过针对磷酸丙糖异构酶基因的聚合酶链式反应来识别CdC，该基因是一种物种特异性的看家基因，广泛用于艰难梭菌的分子鉴定。tpi基因被选用来检测总体艰难梭菌携带情况，无论其产毒状态如何，因为本研究的主要目的是评估CdC及其流行病学关联，而不是区分产毒菌株和非产毒菌株。
PCR扩增使用先前验证的引物进行。检测到预期的300bp tpi扩增子被认为是CdC的指征。
人口统计学、生活方式和实验室变量收集
人口统计学特征、生活方式因素和实验室数据从台南县政府卫生局维护的标准化问卷和医疗记录中获取。生活方式变量作为分类数据收集，包括吸烟状况、饮酒、槟榔使用、口腔卫生习惯、身体活动和饮食习惯。实验室参数包括血清白蛋白、肝酶、血尿素氮、血清肌酐、尿酸、空腹血糖、血脂谱、全血细胞计数、乙型肝炎表面抗原、丙型肝炎抗体和iFOBT结果。
肠道菌群的16S rRNA宏基因组分析
为了探索与CdC和吸烟状况相关的肠道菌群差异，对一部分样本进行了16S rRNA基因测序。根据DNA的可用性和质量，选择了10份来自CdC参与者的样本和10份来自无CdC参与者的样本。微生物群分析被设计为探索性、产生假设的调查，而非确定性的比较分析。
测序针对细菌16S rRNA基因，并在门和属水平上分析细菌类群的相对丰度。使用相对丰度的条形图和热图来可视化微生物群组成。应用线性判别分析效应量来识别在组间差异富集的分类群，强调效应量和生物学相关性。
统计分析
使用SPSS统计软件进行统计分析。连续变量以中位数和四分位距表示，并使用曼-惠特尼U检验进行比较。分类变量以计数和百分比表示，并根据情况使用费希尔精确检验进行比较。
在单变量分析中P< 0.10的变量被考虑纳入多变量逻辑回归模型，以识别与艰难梭菌定植相关的独立因素。优势比和调整后优势比以95%置信区间报告。双侧P值 < 0.05被认为具有统计学意义。
伦理声明
本研究根据《赫尔辛基宣言》的原则进行，并获得国立成功大学医院机构审查委员会的批准。基于此批准，获得了台南市政府的许可以使用台南市政府生物样本库的标本。所有受试者在标本储存前均提供了知情同意。
结果
在本研究中，收集了250份成年参与者的残留粪便标本，并进行了基因组DNA提取和艰难梭菌tpi基因PCR分析。共有29名参与者的粪便样本检测出tpi基因阳性，表明存在艰难梭菌携带。其余221名参与者没有检测到艰难梭菌携带。CdC组和NCdC组的平均年龄相似，CdC组年龄> 60岁的参与者比例高于NCdC组。在单变量分析中，男性在CdC组中比在NCdC组中更常见，尽管这种关联未达到统计学显著性。两组之间在生化实验室数据、血细胞计数数据或iFOBT阳性比例方面没有显著差异。在生活方式方面，CdC组有吸烟史的比例高于NCdC组。两组在体脂、饮酒、槟榔使用、口腔卫生、身体活动或饮食习惯方面无显著差异。多元逻辑回归分析显示，吸烟与CdC独立相关。
在肠道菌群的16S宏基因组分析中，厚壁菌门是最丰富的门，其次是拟杆菌门、放线菌门和变形菌门，在CdC和NCdC样本中均是如此。变形菌门在CdC组中的丰度高于NCdC组；相比之下，拟杆菌门和梭杆菌门在NCdC组中的丰度高于CdC组。在属水平上，Subdoligranulum、Klebsiella、Blautia和Bifidobacterium在CdC组中的丰度高于NCdC组。而Romboutsia、Faecalibacterium、Enterococcus和Prevotella 9在NCdC组中的丰度高于CdC组。两组中35个不同属的相对丰度在物种丰度热图中展示。LEfSe分析确定了在CdC组中富集的属为Virgibacillus和Oceanobacillus。然而，梭杆菌目和普雷沃菌科被确定为在NCdC组中富集的分类群。
对吸烟者和非吸烟者肠道菌群的16S宏基因组分析显示，放线菌门和厚壁菌门在吸烟者中的丰度高于非吸烟者。相比之下，绿弯菌门、变形菌门和梭杆菌门在非吸烟者中的丰度高于吸烟者。属Romboutsia、Blautia和Bifidobacterium在吸烟者中的丰度高于非吸烟者。然而，属Bacteroides、Klebsiella、Agathobacter和Enterococcus在非吸烟者中的丰度高于吸烟者。
讨论
在这项针对台湾南部≥40岁成年人的社区横断面研究中，吸烟被确定为CdC的独立危险因素。与未定植的参与者相比，CdC个体也表现出不同的肠道菌群特征。虽然无法推断因果关系，但这些发现提示吸烟相关的肠道菌群改变与社区中CdC易感性之间存在潜在联系。通过关注社区居住的成年人而非住院人群，本研究强调了无症状定植作为可能促进艰难梭菌传播和后续医疗相关感染的潜在上游储存库。
虽然CdC的已确定风险因素主要来自住院环境，但社区中与生活方式相关的因素仍未得到充分探索。在基于人群的研究中，吸烟与CDI风险增加相关，但将吸烟与CdC和肠道菌群变化联系起来的数据有限。我们的研究结果为以下假设提供了流行病学支持：吸烟相关的菌群失调可能部分损害定植抗性，从而即使在其他方面健康的个体中也促进CdC。在多变量分析中，年龄并未与CdC保持独立相关，这表明在这一人群中，微生物群和生活方式相关因素可能比单纯的实足年龄发挥更重要的作用。这种减弱也可能归因于这个社区队列相对狭窄的年龄分布，该队列主要包括≥40岁的成年人，高龄老人的代表性有限。
在探索性16S rRNA宏基因组分析中，我们观察到与吸烟状况和CdC相关的肠道菌群组成的差异。吸烟者表现出较高的放线菌门和厚壁菌门相对丰度，而非吸烟者表现出相对较高比例的变形菌门和梭杆菌门。这些发现与先前的报告一致，表明吸烟与肠道微生物组成的改变有关，尽管具体受影响的分类群在各研究中有所不同。鉴于样本量有限，应谨慎解释这些观察结果，并应将其视为产生假设而非确定性的。
CdC组和NCdC组之间的比较揭示了不同的微生物特征，包括在CdC个体中变形菌门的相对丰度增加以及某些属（如Klebsiella）的富集。与短链脂肪酸产生和定植抗性相关的分类群的改变在先前关于CdC的研究中已有涉及。然而，各研究之间的不一致性以及具有重叠功能作用的分类群的存在，凸显了宿主-微生物群-病原体相互作用的复杂性。在此背景下，我们的研究结果表明，肠道菌群差异可能有助于CdC易感性，但不太可能作为唯一的决定因素。
LEfSe分析确定了在CdC组中富集的分类群为Virgibacillus和Oceanobacillus。这些属在关于发酵剂启动子的微生物群落分析中已有报道，但在人类肠道中描述较少。它们的生物学相关性仍不清楚。在本研究中，它们的识别并非作为明确的生物标志物，而是突出了与CdC相关的潜在生态特征，需要在更大规模的纵向队列和功能性微生物组分析中进行验证。
本研究有几个局限性需要承认。首先，CdC的检测基于针对tpi基因的PCR，该基因识别物种水平的携带，但不能区分产毒菌株和非产毒菌株。因此，报告的定植率可能高估了产毒艰难梭菌的流行率。然而，本研究的主要目的是描述无症状定植作为一种流行病学储存库的特征，而非评估毒素介导的疾病或当前的流行率估计，并且非产毒菌株可能仍能反映肠道微生物群内的相关生态动力学。
其次，横断面设计妨碍了对吸烟、肠道菌群改变和CdC之间关系的因果推断。某些已确定的风险因素信息，包括先前的抗生素暴露、质子泵抑制剂使用和近期住院情况，无法获取，可能导致残留混杂。第三，参与社区筛查计划是自愿的，这可能会引入选择偏倚，并限制研究结果对偏好接受替代筛查方式的个体的普遍适用性。
最后，肠道菌群分析是在有限数量的样本上进行的，旨在作为探索性、产生假设的调查。小样本量限制了统计效力，并限制了就特定微生物分类群得出明确结论的能力。未来的纵向研究需要更大的队列、详细的用药史和功能性微生物组分析，以验证这些发现并阐明连接生活方式因素、肠道菌群和CdC的机制途径。
总之，这项针对台湾南部≥40岁成年人的社区研究表明，吸烟被确定为CdC的独立危险因素。与未定植的参与者相比，CdC个体表现出不同的肠道菌群特征，提示吸烟相关的微生物群改变与定植易感性之间存在潜在关联。虽然无法建立因果关系，但这些发现强调了在社区获得性CdC的流行病学中考虑可改变的生活方式因素的重要性。需要进一步进行更大规模的纵向研究和功能性微生物组分析，以验证这些观察结果，并阐明其对艰难梭菌传播和预防的意义。
