《Journal of Virology》：Viral genome editing methods and applications in the CRISPR era
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本篇综述系统性阐述了CRISPR-Cas系统在大型DNA病毒基因组精准编辑中的方法学框架与应用价值，为替代或补充传统BAC重组技术提供了（NHEJ/HDR）等多种策略，其中心思想在于通过优化sgRNA设计、供体模板、递送方式与HDR促进策略，实现对（HSV-1/HCMV）等病毒临床分离株的直接、无痕（scarless）编辑，从而推动病毒功能基因组学、抗病毒靶点发现与转化病毒学的发展。
在病毒学研究领域，大型DNA病毒（如疱疹病毒、腺病毒、痘病毒）因其庞大的基因组（通常100-300 kb）和复杂的调控区域，长期以来对其基因组进行精准操作面临巨大技术挑战。在可编程核酸酶出现之前，病毒基因组工程主要依赖体外重组或细菌人工染色体（BAC）克隆系统。尽管基于BAC的方法已成为多种疱疹病毒功能研究的金标准，但它们通常费时费力，经常需要互补细胞系和复杂的选择程序，并且其应用受限于已建立BAC克隆的病毒株。更重要的是，无痕编辑需要额外步骤，且残留的BAC序列通常需要被清除以恢复真实的病毒基因组。相比之下，CRISPR-Cas系统提供了一个更直接、更通用的平台。向导RNA和Cas核酸酶足以在感染细胞内引入靶向DNA切割，从而无需BAC中间体即可实现对病毒基因组的精准修饰。
CRISPR-CAS介导的基因组编辑
CRISPR-Cas系统的核心在于，向导RNA与靶序列杂交，并引导Cas9、Cas12或Cas13等核酸酶至特定位点，导致目标核酸的切割和后续修饰。其中，Cas9和Cas12靶向DNA，而Cas13作用于RNA。本综述主要关注DNA病毒基因组编辑。最广泛使用的核酸酶是化脓链球菌Cas9（SpCas9），它能在单链向导RNA（sgRNA）定义的DNA位点引入双链断裂（DSB）。在真核细胞中，这种断裂主要通过非同源末端连接（NHEJ）或微同源介导的末端连接（MMEJ）进行修复，通常导致插入或缺失（indels）和功能丧失性突变。然而，当存在供体模板时，同源定向修复（HDR）可以实现精确的序列整合。这种双重修复潜力使得CRISPR能够介导基因敲除和精确的基因敲入（包括单核苷酸替换和标签插入）。此外，避免DSB形成的变体，如产生位点特异性单链切口的Cas9切口酶（nCas9）、与转录效应因子融合用于基因抑制（CRISPRi）或激活（CRISPRa）的催化失活Cas9（dCas9），以及像CasMINI这样的超紧凑核酸酶，进一步扩展了系统的多功能性。
利用CRISPR-CAS9进行DNA病毒基因编辑
过去十年，CRISPR-Cas9的应用范围已迅速扩展到包括DNA病毒甚至RNA病毒的整合DNA中间体。病毒学中的主要应用包括抗病毒策略开发、病毒决定因素的功能研究以及疫苗载体的工程化。虽然基本原理与宿主基因组编辑相似，但病毒系统提供了独特的机遇和挑战。在裂解期，病毒基因组大量复制，增加了编辑事件的可能性。细胞核内的病毒复制区室提供了富含病毒蛋白和宿主DNA修复因子的局部环境，创造了有利于CRISPR介导的编辑的条件。同时，病毒基因组编辑对实验时机敏感。感染阶段、感染复数（MOI）以及Cas9和供体模板的递送时机强烈影响编辑结果。病毒基因组的高拷贝数也增加了同一基因座被重复切割的风险，可能导致渐进性的大片段缺失或意外重排。为了最大限度地减少这些事件，供体构建体可以设计在PAM或种子区引入沉默突变以防止再切割。本部分通过一个表格汇总了在单纯疱疹病毒1型（HSV-1）、人巨细胞病毒（HCMV）、水痘-带状疱疹病毒（VZV）、鸭肠炎病毒（DEV）、马立克氏病病毒（MDV）、伪狂犬病病毒（PRV）、火鸡疱疹病毒、EB病毒（EBV）、卡波西肉瘤相关疱疹病毒（KSHV）、乙型肝炎病毒（HBV）、JC多瘤病毒、人类免疫缺陷病毒1型（HIV-1）、人乳头瘤病毒（HPV）和痘苗病毒（VACV）等多种病毒中，针对不同靶基因（如gE、UL23、ICP0、US34、IE1等）进行基因敲除、报告基因（如EGFP、TdTomato）敲入或疫苗株修饰的代表性研究，所采用的编辑策略（HDR或NHEJ）以及CRISPR组分的递送方式。
高效基因组编辑的考量
高效的基因组编辑最终取决于将DNA修复导向所需途径。由于NHEJ在大多数细胞环境中都很活跃，基因敲除通常可以通过相对简单的设计决策实现，尽管由此产生的indels是随机的且限制了精确性。相比之下，基于HDR的敲入允许精确的序列改变，但其操作窗口条件较窄。性能取决于核酸酶特性、供体格式和长度、链偏好、切割到编辑的距离、防止再切割的沉默突变、递送方法和时机，以及在某种情况下的小分子调节。
选择CRISPR-CAS蛋白
核酸酶的选择应基于编辑目标、靶位点附近PAM序列的可用性以及切割位点的特性。SpCas9通常是首选。然而，Cas12家族成员，特别是像Cas12f这样的紧凑型核酸酶，在PAM序列有限、需要多重编辑或载体容量受限时，可以作为有用的替代方案。Cas12a（Cpf1）识别富含T的PAM序列，并在PAM远端切割位点产生交错的5‘突出端，当NGG PAM稀缺或需要同时破坏多个基因座时具有优势。Cas12f是一种小型核酸酶，其紧凑的尺寸使其能够包装到腺相关病毒（AAV）载体中。
选择SGRNA
设计sgRNA需要在靶向活性、脱靶风险以及切割位置相对于所需编辑的位置之间取得平衡。对于敲除，主要目标是确保稳健的切割。对于敲入，切割必须仔细定位在预期修饰位点附近，并且供体设计必须包含在HDR后防止再切割的沉默突变。
供体模板
精确的敲入或替换需要在HDR窗口期间存在供体模板。供体类型、递送方法和同源臂设计取决于细胞类型、感染模型和插入片段大小。供体格式包括：用于SNP或短插入等小编辑的单链寡脱氧核苷酸（ssODN）或长单链DNA（lssDNA）；适用于较大插入的线性双链DNA/质粒双链DNA；在许多细胞类型中提供高敲入效率的AAV；以及支持更大盒式片段递送的整合缺陷型慢病毒载体（IDLV）。无论供体类型如何，都应引入沉默的PAM/种子区突变以防止HDR后的再切割。同源臂的长度因供体格式而异，对于ssODN，每臂通常为30-60 nt；对于lssDNA，每臂约为150-400 nt；对于线性双链DNA/质粒，每臂300-800 bp是常见的。
CRISPR组分的递送方法
在病毒基因组编辑中，高效的递送通常是限速步骤。对于基于HDR的敲入，Cas核酸酶、sgRNA、供体模板和病毒基因组必须在HDR窗口期间共存于同一个细胞和细胞核内。每种递送方法也对其可容纳的CRISPR组分形式施加了限制。重组最活跃的时间是在切割后不久；因此，供体应在该时间达到核内浓度峰值。共递送RNP和供体通过电穿孔可以使切割起始与供体可用性同步，并缩短核酸酶暴露时间，通常能减少脱靶效应和再切割。递送方法主要包括：
- 1.
转染：脂质体转染是最简单、可重复性最高的递送方法之一，特别适用于HEK293、HeLa或Vero等许可细胞系。
- 2.
电穿孔：是转染困难细胞（包括原代细胞、单核细胞、CD34+造血祖细胞和悬浮细胞系）最通用、最有效的方法。它特别适用于递送Cas9 RNP。
- 3.
病毒载体：整合慢病毒支持Cas9/sgRNA的长期表达，适用于筛选或需要持续活性的系统。IDLV提供瞬时表达，广泛用于供体递送。rAAV已成为精确敲入的金标准供体载体。
增强HDR的小分子
细胞主要通过NHEJ修复DSB，而HDR仅限于细胞周期的S期和G2期。在宿主基因组编辑中，细胞周期调节剂如诺考达唑、长春花碱和RO-3306通过使细胞同步在G2/M期（此时同源重组最活跃）来增加HDR。类似地，CDC7抑制剂XL413延长S期持续时间，为HDR提供了更长的窗口。然而，这些策略在病毒基因组编辑中可能效果较差，因为感染在细胞群体中是异步进行的。几种抑制NHEJ的小分子已被用于增强HDR。DNA-PKcs抑制剂如NU7026和M3814（peposertib）可将HDR效率提高约2-4倍。高效的DNA-PK抑制与大片段的缺失、染色体臂丢失和易位有关，引发了基因组不稳定的担忧。DNA连接酶IV抑制剂SCR7可防止DNA末端连接，从而阻断NHEJ。直接刺激同源重组的化合物也已被探索。RS-1通过稳定RAD51在单链DNA上的丝状结构来增强HDR。染色质重塑提供了另一种途径：组蛋白乙酰化使染色质松弛为常染色质状态，增加了DNA可及性。组蛋白去乙酰化酶抑制剂，如曲古抑菌素A，在iPSC中将HDR提高了多达4倍。
筛选与选择方法
基于荧光的筛选标记
荧光报告基因通常被整合作为标记，以富集或识别成功编辑的病毒基因组。已开发了几种策略：
- 1.
内部核糖体进入位点：允许从单个转录本独立翻译两个ORF，从而保留目标蛋白的氨基酸序列。但翻译效率偏向上游ORF，下游ORF的表达通常显著降低。
- 2.
2A自切割肽：使两个几乎等摩尔的蛋白质能够通过核糖体跳跃从单个ORF产生。这种平衡的表达有利于可靠的选择。缺点是2A序列会留下短的肽段疤痕。
- 3.
基于内含子的插入策略：报告基因在内含子内的整合提供了一种无疤痕的标记方法。GEIS系统和CRISPIE方法实现了在不改变编码序列的情况下对目标基因表达进行可视化，或对蛋白质进行功能性标记。
- 4.
两步选择：当需要完全无疤痕的编辑时，可以应用两步策略。第一步，通过HDR在靶位点附近插入一个可移除的GFP或药物抗性盒，以便于筛选阳性克隆。第二步，精确移除该盒，只留下预期的突变而没有任何额外的序列。
编辑病毒的克隆纯化
基因组编辑后，最初的病毒群体是异质的，编辑和未编辑的基因组通常共存于同一个感染细胞中。因此，克隆纯化是必不可少的。克隆纯化方法包括：
- 1.
噬斑纯化：在半固体覆盖层上进行噬斑分离仍然是DNA病毒的标准方法。荧光报告基因可以通过直接选择阳性噬斑来加速这一过程。
- 2.
细胞分选：当有荧光报告基因或其他可检测标记时，可以使用流式细胞术预富集感染细胞。
- 3.
终点稀释：连续稀释确保单个孔平均接收少于一个感染单位。然后扩增显示细胞病变效应的孔。
- 4.
液滴微流控：微流控液滴系统将单个感染细胞或病毒粒子封装在纳升级别的隔室中，实现了高通量的分离和分析。
基因组编辑的确认
获得分离的候选克隆后，需要进行基因型和表型验证。主要目标是：确认预期的靶向修饰是否发生；排除不需要的重排、大片段缺失或供体骨架残留；评估编辑后的病毒是否保持预期的生长和功能特性。
- 1.
基因型分析：通常通过连接点PCR和跨越供体-基因组连接处的Sanger测序来验证靶向编辑。对于定量评估，可以进行基于扩增子的二代测序，以分析突变谱。为了评估潜在的脱靶效应，可以对预测的顶级脱靶位点进行扩增和测序。
- 2.
表型分析：表型验证对于确定编辑后的病毒是否保持预期的复制动力学和蛋白质功能至关重要。标准检测包括单步和多步生长曲线、噬斑大小比较以及相对于野生型对照的病毒产量定量。
应用与代表性研究
CRISPR为基础的基因组编辑通过实现对大型DNA基因组的精准操作，扩展了疱疹病毒研究的实验和转化范围。两项案例研究说明了这些设计原则如何成功实施。
HCMV中生长素诱导降解子介导的蛋白质控制
编辑难以转染的人包皮成纤维细胞（HFFs）中的HCMV是一项重大技术挑战。在这项研究中，使用IDLV将Cas9/sgRNA与供体模板一起递送到感染细胞中。供体模板设计在两端带有额外的Cas9切割位点，以促进体内线性化，从而提高HDR效率。一个生长素诱导降解子（AID）标签与一个P2A-GFP模块一起被插入到IE1基因的下游，创建了一个兼具视觉选择和诱导降解双重功能的构建体。在HFF-TIR1细胞中，用吲哚-3-乙酸处理触发了AID标记的IE1蛋白的快速降解，证实了在病毒背景下应用蛋白质靶向降解系统的可行性。
HSV-1必需基因的CRISPR编辑策略
编辑必需的病毒基因需要在整个过程中保持病毒活力的策略。本例采用了两步敲入/敲除替换方法，在HSV-1的必需基因UL36中引入点突变。首先，使用HDR将CMV启动子-eGFP-IRES盒插入到UL36的上游，实现eGFP和必需UL36蛋白的同时表达。这确保了即使在中间编辑阶段病毒也能繁殖。然后，从这个中间体病毒中进行第二轮HDR，以移除GFP盒并引入C40S点突变（该突变废除了UL36的N末端去泛素化酶活性）。选择GFP阴性的噬斑并通过测序验证。该策略提供了几个优点：在编辑过程中保留了必需基因的表达；无需互补细胞系；与BAC重组相比缩短了时间；并且通过盒式替换实现了无疤痕编辑。
结论与展望
本综述为将CRISPR-Cas系统应用于DNA病毒基因组编辑提供了一个实用的框架，展示了它们作为传统BAC重组技术的替代和补充方法的潜力。重点总结了对大型DNA病毒进行基因敲除和敲入策略的关键设计考虑，以提高其精确性和效率。尽管存在细胞类型依赖性、递送挑战和潜在基因组不稳定性等实际问题，但CRISPR技术的独特优势在于其能够直接编辑临床分离株，而无需BAC克隆。这种能力极大地提高了实验速度、可及性和适应性，为功能病毒学的新时代铺平了道路。通过将严格的验证标准与CRISPR工具的灵活性相结合，研究人员可以在保持科学严谨性的同时，安全地利用该技术的优势。CRISPR系统的持续改进，加上递送、生物信息学和合成病毒学方面的进步，最终将改变我们在基因组水平上操作和理解大型DNA病毒的方式。
