《Microbiology Spectrum》：Neuraminidase of influenza A viruses induces global desialylation of host cells via its intracellular function
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本研究揭示了甲型流感病毒（IAV）神经氨酸酶（NA）在宿主细胞内部的全新功能。文章通过系统的糖组学、功能分析与超感染实验，首次证实NA在细胞内（高尔基体）即可获得酶活，介导了宿主细胞表面糖蛋白的全局去唾液酸化及α1-2岩藻糖重修饰。这不仅为病毒颗粒的释放扫清了唾液酸受体的障碍，还可能通过塑造独特的细胞表面糖谱，限制了病毒的二次感染（superinfection）。这一发现为理解流感病毒的进化策略（在高效复制与基因重配间寻求平衡）以及开发靶向NA功能的新型抗病毒药物提供了全新的视角。
INTRODUCTION
甲型流感病毒（IAV）是正粘病毒科的一员，其囊膜上含有两种关键糖蛋白：血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）。HA负责通过结合唾液酸化糖缀合物来介导病毒附着于宿主细胞，而NA则作为唾液酸苷酶，水解唾液酸，其经典功能被认为是在病毒出芽时破坏病毒受体，促进病毒颗粒从感染细胞中高效释放并传播感染。尽管NA在病毒颗粒上的功能已被广泛研究，但NA的成熟及其在感染细胞内部的细胞内功能却所知甚少。已有研究表明，IAV感染会导致细胞糖组发生广泛改变，例如出现末端半乳糖暴露和糖链被α1-2岩藻糖重修饰（recapping）的现象。由于α1-2岩藻糖基转移酶（FUT1/FUT2）定位于高尔基体，这些独特的糖结构暗示了NA在IAV感染细胞内可能存在潜在功能。本研究旨在深入探究NA的细胞内功能及其对感染细胞糖组重塑的影响。
RESULTS
Changes in the glycan profiles on the surface of MDCK cells infected with an IAV
为验证先前报道的IAV感染MDCK细胞引发的糖组改变，本研究使用凝集素微阵列分析了感染A/Puerto Rico/8/1934（H1N1）（PR8）毒株的MDCK细胞表面糖谱。结果显示，与模拟感染细胞相比，PR8感染细胞上唾液酸化聚糖特异性凝集素（如MAL-I、SNA、SSA、TJA-I）的信号强度降低，而特异性识别末端乳糖胺（LacNAc）或其簇的凝集素（如ECA、RCA120、BPL、WFA）信号增强，表明感染细胞表面发生了去唾液酸化。值得注意的是，特异性识别α1-2岩藻糖的凝集素TJA-II在PR8感染细胞中信号增强，而识别α1-3半乳糖的凝集素EEL信号则未显著升高。这些结果表明，IAV感染诱导细胞表面聚糖末端从唾液酸转变为α1-2岩藻糖。
Global desialylation and α1-2 fucosylation on the surface of IAV-infected MDCK cells
进一步的免疫荧光与凝集素染色实验证实了上述发现。与SNA（特异性结合唾液酸）染色信号在HA阳性（即病毒感染）细胞表面减弱相反，UEA-I（特异性结合α1-2岩藻糖）的信号在PR8感染细胞表面显著增强。这些结果共同证明了PR8感染后在HA阳性的MDCK细胞表面发生了去唾液化和α1-2岩藻糖重修饰。研究还扩展至不同NA亚型（N1至N9）的鸭源流感病毒感染MDCK细胞，发现除N3亚型外，几乎所有病毒株感染均导致UEA-I信号显著增加，表明α1-2岩藻糖增加是IAV感染MDCK细胞中普遍存在的糖谱改变。在A549和Vero E6细胞系中，IAV感染同样导致SNA信号减弱（去唾液化），但未观察到UEA-I信号的增强，提示α1-2岩藻糖重修饰高度依赖于宿主细胞特异的糖合成机制。
α1-2 fucosylation in IAV-infected cells is induced by the latter part of a viral replication cycle
时间进程分析显示，在感染复数（MOI）为1的PR8感染MDCK细胞中，SNA信号在感染后3小时开始下降，6小时和9小时显著降低；而UEA-I阳性细胞比例在6小时感染后增加，并在6小时和9小时时在核周区域观察到高强度信号。免疫染色显示，病毒核蛋白（NP）在感染后3小时定位于细胞核，6小时核输出，这一时间线与病毒蛋白表达阶段吻合，表明病毒复制周期的后期（包括病毒蛋白表达和组装）诱导了感染细胞的糖组改变。此外，使用帽依赖性核酸内切酶抑制剂巴洛沙韦酸（BXA）抑制病毒蛋白表达后，SNA信号的降低不受影响，但UEA-I信号的增强被显著抑制。这进一步表明，糖组改变并非由病毒进入引发，而是与病毒基因转录、蛋白表达或组装等后期事件相关。
NA expression in MDCK cells induced desialylation and glycan recapping with α1-2 fucose
为了探究NA在糖组改变中的作用，研究团队建立了稳定表达PR8 NA或Vac2 NA的MDCK细胞系。凝集素微阵列分析显示，这些NA表达细胞呈现出与PR8感染细胞相似的糖谱特征：唾液酸化糖特异性凝集素信号低，而识别末端LacNAc和α1-2岩藻糖的凝集素信号高。免疫荧光染色同样证实了NA表达细胞中SNA信号降低和UEA-I信号增强。重要的是，RT-qPCR检测发现，NA表达并未上调内源性α1-2岩藻糖基转移酶基因（FUT1和FUT2）的表达水平。这些结果表明，NA的表达本身足以诱导细胞发生去唾液化和α1-2岩藻糖重修饰，且这一过程不依赖于宿主相关基因的上调。
Catalytic activity of NA is necessary for desialylation and glycan recapping with α1-2 fucose
为了验证NA的酶催化活性是否为此糖组改变所必需，研究构建了NA催化失活突变体（E119V, D151G, I222L）并在MDCK细胞中表达。与表达野生型（WT）NA的细胞相比，表达E119V和D151G突变体的细胞保留了较高的SNA信号，且UEA-I信号显著降低；I222L突变体的影响则有限。这直接证明了NA的催化活性对于MDCK细胞中去唾液化和α1-2岩藻糖重修饰是必需的。
Intracellular NA function is crucial for glycan recapping with α1-2 fucose in the IAV-infected cells
由于α1-2岩藻糖基转移酶定位于宿主细胞的高尔基体，感染细胞中观察到的α1-2岩藻糖重修饰暗示NA是在细胞内部（如高尔基体）发挥功能，移除聚糖末端的唾液酸，为α1-2岩藻糖基转移酶提供了底物LacNAc。为了区分NA的细胞内和细胞外功能，研究者用不同的NA抑制剂（拉尼那米韦、拉尼那米韦辛酸酯、奥司他韦羧酸盐）处理表达NA的MDCK细胞。结果显示，使用可被细胞摄取并在细胞内转化为活性形式的拉尼那米韦辛酸酯处理，能显著降低细胞表面的UEA-I信号；而主要作用于细胞外NA的拉尼那米韦和奥司他韦羧酸盐则不影响UEA-I信号。这强烈表明，α1-2岩藻糖重修饰依赖于NA的细胞内活性，而非其细胞外（即病毒颗粒表面）的活性。
在病毒感染实验中，用高感染复数（MOI=100）的PR8感染MDCK细胞，无论是否用BXA处理（抑制病毒蛋白合成），SNA信号在感染后3小时均下降。然而，只有在未用BXA处理的细胞中，从6小时起才能观察到UEA-I信号的增强。此外，用霍乱弧菌来源的重组NA（细胞外作用）处理细胞，仅能引起SNA信号下降，而无法诱导UEA-I信号上升。这些结果一致证明，细胞内NA功能对于IAV感染细胞中α1-2岩藻糖重修饰是必要的，而细胞外NA功能无法诱导此重修饰。
NA function contributes to superinfection exclusion in IAVs
鉴于唾液酸是IAV附着宿主细胞的初始受体，感染细胞因细胞内NA功能导致的去唾液化，可能会干扰病毒的二次感染（即超感染）。超感染实验表明，当PR8和Vac2-FLAG病毒先后感染MDCK细胞时，若两次感染间隔2小时或更长，第二次感染的病毒（通过检测其NA蛋白）阳性细胞比例下降；当间隔达到5或6小时，则完全检测不到二次感染的病毒。时间进程分析显示，感染后5小时，细胞表面去唾液化明显，且α1-2岩藻糖信号增强，病毒NA表达也已明确。这表明，由细胞内NA功能介导的糖谱改变（特别是唾液酸的缺失），导致了感染后期（约5小时后）的完全超感染排斥。此外，在稳定表达PR8 NA的MDCK细胞中，PR8病毒的复制能力显著降低（滴度比亲代细胞低104倍），进一步支持了NA表达通过改变细胞表面糖谱限制了IAV的感染。
DISCUSSION
本研究揭示了一种NA功能的新模式：NA在病毒生命周期中，于细胞内（高尔基体）即获得酶活性，诱导宿主细胞发生全局去唾液化，并促进糖链末端被α1-2岩藻糖重修饰。这一过程不仅通过减少唾液酸“陷阱”为病毒出芽释放提供了便利，还通过改变细胞表面受体景观，限制了二次病毒感染的机会，从而塑造了IAV超感染的严格时间窗口。
研究指出，糖链重修饰为α1-2岩藻糖（即H抗原）的现象可能具有未知的生物学意义，有助于区分感染与非感染细胞。同时，研究也观察到糖谱改变存在细胞类型依赖性，例如在A549和Vero E6细胞中仅观察到去唾液化而无明显的α1-2岩藻糖化，这表明细胞内NA功能普遍导致去唾液化，而具体的重修饰结果取决于宿主细胞的糖合成机制。
在应用层面，该发现为抗流感药物研发提供了新思路。目前常用的NA抑制剂（如奥司他韦）主要针对细胞外（病毒颗粒）的NA活性，而对细胞内NA功能的抑制效果有限（如拉尼那米韦辛酸酯显示出一定的细胞内抑制潜力）。因此，理解NA的细胞内作用机制，可能有助于开发能够靶向细胞内NA功能的新型抗病毒药物。
总之，本研究阐明了NA在IAV感染周期中一个此前未被充分认识的细胞内功能，它不仅促进了病毒的有效释放，还可能通过调控细胞表面糖基化来影响病毒的进化策略，即在确保病毒成功复制和允许基因重配之间维持一种精妙的平衡。这些发现深化了对流感病毒生命周期的基本理解，并具有潜在的抗病毒治疗意义。
