靶向Warburg效应：乳酸转运蛋白MCT1及其伴侣蛋白在18β-甘草酸诱导的癌细胞死亡中的作用

《Biochemical and Biophysical Research Communications》：Targeting Warburg effect: involvement of lactate transporter MCT1 and its chaperone in cancer cell killing by 18β-glycyrrhetinic Acid

本研究通过全基因组CRISPR筛选，发现MCT1（SLC16A1）及其膜伴侣BSG是18β-甘草次酸诱导癌细胞死亡的关键，揭示了Warburg效应增强癌细胞MCT1表达，从而提高该药物敏感性，为中药抗肿瘤提供新策略。

　　

Bingxin Xia|Chen Zhu|Yi Rao

北京大学生命科学学院，药学科学系，化学与化学工程学院，北京-清华生命科学中心，先进跨学科研究学院，化学与生物工程系，药学科学学院，PKU-IDG/McGovern脑科学研究研究所，北京 100871

摘要

甘草是最常用的中药之一，其主要成分是甘草酸，其衍生物18β-甘草酸（18β-GA）具有抗肿瘤活性。在这里，我们进行了全基因组CRISPR筛选，以识别对18β-GA敏感所需的基因。我们发现乳酸转运蛋白MCT1及其膜伴侣蛋白BSG参与了18β-GA对癌细胞的杀伤作用。MCT1对于癌细胞摄取18β-GA是必需且充分的。BSG对于MCT1在膜上的定位以及18β-GA进入癌细胞并导致癌细胞死亡是必需的。虽然已知癌症中的Warburg效应会增加乳酸的产生，进而选择更高表达水平的MCT1来通过 export 乳酸来增强癌细胞的存活，但我们的发现揭示了一种新的机会，即通过提高高MCT1表达的癌细胞的18β-GA敏感性来杀死癌细胞。因此，我们的结果揭示了一个18β-GA敏感性的生物标志物，并提出了利用Warburg效应使药物进入肿瘤细胞的可能性，这将促进进一步的分子机制研究和传统中药的改进。

引言

在现代医学引入之前，中医药已经帮助中国度过了数千年。其中最常用的中药之一是甘草（Glycyrrhiza glabra），它有着悠久的历史[1]，[2]。从其根中提取的主要化学物质是甘草酸，该物质在肠道细菌的作用下水解为18β-甘草酸（18β-GA）[3]，[4]。

癌症继续对全球健康构成重大挑战，传统治疗方法常常受到药物耐药性和不良反应的限制。一百年前，Otto Warburg发现了癌细胞代谢的一个特征[5]，[6]，[7]，随后Carl和Getty Coris也证实了这一发现[8]，[9]，[10]，[11]，[12]。最初认为癌细胞中的糖酵解会增加，而氧化磷酸化会减少，但后来的共识是即使在有氧条件下，也只有糖酵解会增加，同时会产生更多的乳酸[5]，[6]，[7]，[10]，[11]。

发现新的治疗剂和分子靶点是推进癌症治疗的关键。一些值得注意的抗癌药物来自植物，例如紫杉醇和长春碱类，它们最终成为卵巢癌等常见癌症的一线治疗选择[13]。18β-GA已被发现具有抗癌作用[14]，[15]，对多种癌细胞表现出广谱活性[16]，[17]，[18]，[19]。18β-GA可以抑制癌症生长和转移的关键途径，如PI3K/Akt、MAPK/ERK1/2和Akt/mTORC1/STAT3 [14]，[17]，[20]，[21]。尽管关于18β-GA的抗癌机制有很多研究，但对于允许18β-GA进入细胞的细胞膜分子基础知之甚少[22]，[23]，[24]。

CRISPR-Cas9提供了一种强大的基因修饰技术[25]，衍生技术是利用CRISPR-Cas9进行基因的功能筛选[26]，[27]，[28]，[29]，[30]。它可以用来发现药物敏感性和耐药性的潜在机制[29]，[31]，[32]。

在这项研究中，我们应用CRISPR-Cas9进行筛选，系统地寻找对18β-GA反应性所需的基因。我们发现单羧酸转运蛋白1（MCT1，也称为SLC16A1）及其膜伴侣蛋白BSG是18β-GA敏感性所必需的。

溶质载体（SLC）参与细胞质和囊泡运输。人类中的SLC16家族有14个成员，它们是依赖电化学Na⁺或H⁺梯度的次级主动转运蛋白[33]，[34]，[35]，[36]。MCT1是SLC16家族的成员，是一种质子耦合的转运蛋白，能够转运乳酸和丙酮酸等单羧酸[37]，[38]，[39]，[40]，[41]。BSG是MCTs的伴侣蛋白，对于MCT1、MCT3和MCT4在膜上的定位至关重要[42]，[43]，[44]，[45]，[46]，[47]。在癌症中发现了MCT1的过表达[36]，[48]，[49]，[50]，[51]，[52]，[53]，[54]，[55]，[56]。MCT1允许乳酸从进行有氧糖酵解的癌细胞中排出，这对癌细胞代谢至关重要。之前针对癌细胞Warburg效应的策略是通过化学化合物抑制MCT1[57]，[58]，[59]，[60]。由于乳酸体积很小，因此并不明显能够将有毒分子标记到通过MCT1的分子上。

我们的进一步研究表明，18β-GA依赖于MCT1进入癌细胞，而MCT1的高表达使细胞对18β-GA更加敏感，这表明像18β-GA这样比乳酸大得多的分子也可以通过MCT1运输，从而通过Warburg效应靶向癌细胞，为癌症治疗提供了一种新的策略。

章节片段

细胞培养试剂和抗体

H1975和A375细胞系由北京大学的Wensheng Wei博士提供。A375细胞在Dulbecco’s minimum eagle培养基（DMEM）中培养。H1975细胞在Roswell Park Memorial Institute（RPMI）1640培养基中培养。所有细胞都添加了10%的胎牛血清（FBS）和1%的青霉素/链霉素，在含有5% CO₂的潮湿培养箱中于37°C下培养。

DMEM、RPMI 1640、胰蛋白酶和FBS均购自Life Technologies/Gibco Laboratories（美国纽约州Grand Island）。

数据可用性

本文报告的原始序列数据已存放在中国国家基因组数据中心（NCGB）的基因组序列档案库[63]中[64]，由中国科学院北京基因组研究所（GSA-Human：HRA014110），公众可通过以下链接访问：https://ngdc.cncb.ac.cn/gsa-human

基于CRISPR的全基因组筛选，寻找对18β-GA敏感性所需的基因

我们检测了18β-GA对人类非小细胞肺癌细胞H1975的毒性作用。18β-GA的半数有效浓度（EC₅₀）为112.3 μM，与其他细胞系的观察结果一致[14]。测量细胞外乳酸脱氢酶（LDH）和细胞内三磷酸腺苷（ATP）水平显示，18β-GA以剂量依赖性（图1A-C）和时间依赖性（图1D-F）的方式诱导H1975细胞死亡。

为了找到相关基因

讨论

我们进行了全基因组CRISPR筛选，以识别对18β-GA敏感所需的基因，18β-GA是一种已知具有抗癌活性的中药成分。我们发现乳酸转运蛋白MCT1及其膜伴侣蛋白BSG是决定18β-GA敏感性的关键因素。MCT1在细胞摄取18β-GA中起关键作用，而BSG对于MCT1定位到质膜上是必需的。SLC16A1 mRNA的水平可以预测人类癌细胞的18β-GA敏感性。我们的研究

资金声明

本研究未获得公共部门、商业部门或非营利部门的任何特定资助。

CRediT作者贡献声明

Bingxin Xia：撰写 – 原稿撰写、可视化、验证、监督、软件使用、资源提供、项目管理、方法设计、实验实施、数据分析、概念构思。Yi Rao：撰写 – 审稿与编辑、概念构思。Chen Zhu：撰写 – 审稿与编辑、方法设计

利益冲突声明

作者声明与本文内容无利益冲突。

致谢

我们感谢北京大学的Wensheng Wei博士提供了CRISPR文库质粒和表达Cas9的细胞系。我们感谢国家生物科学研究院（NIBS）的Eric Erquan Zhang和Guotai Xu博士，以及北京大学的Peng Du、Zhengfan Jiang和Zexian Zeng博士提供的癌细胞系。我们还要感谢CIBR的生物质谱中心以及Xiangli Sun女士和Xiaoqian Yu女士在LC-MS方面的协助。