《Biochemical Pharmacology》：Illuminating chromaffin granules: compartmentalization of endocannabinoids in bovine adrenal glands supports role in hormone modulation
编辑推荐：
本研究聚焦于内源性大麻素系统（ECS）在肾上腺应激反应中的调控作用，针对其在该关键外周内分泌器官中的空间分布与功能机制尚不清楚的难题。研究人员以牛肾上腺为模型，通过先进的靶向代谢组学和基于活性的蛋白质分析（ABPP）技术，揭示了2-AG在髓质、AEA及RVD-血加压素在皮质存在显著区室化分布，并首次报道了嗜铬颗粒内富集N-亚油酰基乙醇胺（LEA）的现象。在肾上腺皮质细胞中，AEA与RVD-血加压素被发现可调节孕酮分泌。该研究不仅首次描绘了嗜铬颗粒的完整代谢组学图谱，还为理解ECS在肾上腺生理学及激素生成调控中的核心作用提供了关键新证据，推动了该领域进一步研究。
当身体面临威胁，肾上腺会像警报中心一样迅速启动，释放“战斗或逃跑”激素——肾上腺素，并协调皮质醇等糖皮质激素的分泌。这背后涉及下丘脑-垂体-肾上腺轴和交感-肾上腺髓质两大经典通路。然而，科学家们发现，在这两大“主控系统”之外，可能还存在一些精细的“本地调节员”，悄悄影响着肾上腺激素的合成与释放。其中，内源性大麻素系统（Endocannabinoid System, ECS）就是一个备受关注但知之甚少的“潜在调节员”。ECS是一个遍及全身的脂质信号网络，在神经系统中扮演着“刹车”角色，通过抑制突触信号传导来调节压力反应。但它在肾上腺这个关键压力反应器官中究竟扮演什么角色，是调节髓质的肾上腺素释放，还是影响皮质的类固醇合成？其内源性信号分子（如anandamide, AEA和2-arachidonoylglycerol, 2-AG）在肾上腺内部是如何分布的？特别是近年来发现的源自血红蛋白的肽类内源性大麻素（pepcans，如RVD-血加压素），有研究暗示其可能由富含儿茶酚胺的肾上腺髓质嗜铬细胞产生，但这假说从未被严格验证。对这些基本问题的缺失，限制了我们全面理解肾上腺应激反应的调控网络。为了填补这些空白，一项题为“照亮嗜铬颗粒：牛肾上腺中内源性大麻素的区室化支持其在激素调控中的作用”的研究在《Biochemical Pharmacology》上发布，为我们揭开了肾上腺ECS的神秘面纱一角。
研究者们运用了一系列前沿技术来探索这些问题。他们利用牛肾上腺体积大、皮质髓质分界清晰的特点，精确分离了不同区域。通过液相色谱-电喷雾电离-串联质谱（LC-ESI-MS/MS）进行靶向脂质组学和肽组学分析，定量检测了不同区域及纯化嗜铬颗粒中的eCBs、相关脂质及pepcans。采用基于活性的蛋白质分析（ABPP）结合选择性抑制剂，可视化了皮质和髓质中参与eCB代谢的关键丝氨酸水解酶（如FAAH, MAGL）的活性谱。为了特异性标记和研究嗜铬颗粒，研究人员合成了靶向囊泡单胺转运体2的新型荧光探针CV-28，并结合流式细胞术、动态光散射、冷冻电镜和蛋白质印迹对纯化的颗粒进行了表征和质量控制。此外，研究还利用人肾上腺皮质癌细胞系NCI-H295R评估了AEA和RVD-血加压素对类固醇生成的影响。
3.1. 肾上腺髓质和皮质中eCBs及相关脂质的差异特征
靶向脂质组学分析发现，2-AG在髓质中显著更丰富，而包括AEA在内的N-酰基乙醇胺（NAEs）则在皮质中水平更高。这提示AEA和2-AG在肾上腺两个主要功能区中存在明显的空间区室化分布。
3.2. 肾上腺皮质和髓质中ECS基因的表达分析
对人类GTEx数据库的分析证实了ECS组分在肾上腺中的功能性表达。在牛肾上腺中的qPCR分析进一步显示，CNR1和ABHD6的mRNA在皮质中表达更高，而FAAH的mRNA在髓质中更丰富，这与脂质分布数据相呼应。
3.3. 鉴定肾上腺中参与eCB代谢的丝氨酸水解酶
ABPP分析显示，肾上腺髓质和皮质均含有活跃的FAAH、MAGL和ABHD6。髓质中FAAH显示出两个不同的活性条带，并且含有显著的羧酸酯酶活性，而皮质中则没有。
3.4. 肾上腺髓质和皮质中的eCB水解速率
功能水解实验证实，髓质的AEA基础水解速率显著高于皮质，且主要由FAAH介导。相反，皮质的2-OG（作为2-AG的替代物）基础水解速率更高，主要由MAGL和ABHD6介导。而在髓质，2-OG的水解则由MAGL、ABHD6和CES1共同负责。
3.5. 用于检测VMAT2表达大密芯囊泡的荧光探针的合成和生物学表征
研究成功合成了新型荧光VMAT2探针CV-28，其抑制[3H]多巴胺摄取的效力与利血平相当。CV-28能特异性标记表达VMAT2的PC12细胞内的囊泡结构以及纯化的嗜铬颗粒，而不能标记不表达VMAT2的对照细胞，证明其作为研究VMAT2阳性细胞器的有效工具。
3.6. 牛肾上腺大密芯囊泡的分离和表征
通过差速离心和蔗糖梯度超速离心纯化了牛肾上腺嗜铬颗粒，动态光散射和冷冻电镜证实其为粒径约255纳米的均一囊泡群。Western blot显示线粒体污染极少。颗粒内含有极高浓度的去甲肾上腺素和肾上腺素，以及显著浓度的谷氨酸、血清素、亮氨酸和甘氨酸。
3.7. 嗜铬颗粒的全面靶向分析排除了肽类eCB货物
靶向肽组学分析显示，纯化的嗜铬颗粒中完全检测不到RVD-血加压素（pepcan-12）及其前体pepcan-23。相反，这两种肽在肾上腺皮质中的含量显著高于髓质。这直接否定了pepcans由嗜铬颗粒存储和释放的假说。
3.8. 嗜铬颗粒中eCB水平低但富含N-亚油酰基乙醇胺
嗜铬颗粒中AEA和2-AG的浓度显著低于整个髓质组织。有趣的是，多不饱和的N-亚油酰基乙醇胺在颗粒中相对于髓质组织被特异性富集了约10倍，而其他NAEs则无此现象。
3.9. RVD-血加压素（pepcan-12）调节肾上腺皮质NCI-H295R细胞中的孕酮分泌
在NCI-H295R细胞中，AEA和RVD-血加压素能调节类固醇生成。在基础状态下，AEA和WIN55,212-2能增加孕酮分泌并降低睾酮分泌，而RVD-血加压素能增强AEA的这种效应。在福斯高林刺激下，仅RVD-血加压素能显著增加孕酮。
本研究系统揭示了牛肾上腺内ECS存在清晰的空间与功能区室化：皮质是AEA和RVD-血加压素主导的区域，而髓质是2-AG主导的区域。这种分布差异由不同区域特异的丝氨酸水解酶活性谱所驱动。研究首次提供了嗜铬颗粒的全面代谢组学数据，发现了谷氨酸、血清素、特定氨基酸（如亮氨酸）的显著存储，同时明确了经典eCBs（AEA, 2-AG）并非显著储存在颗粒内，但意外发现了N-亚油酰基乙醇胺的特异性富集。更重要的是，研究明确排除了肽类内源性大麻素（pepcans）通过嗜铬颗粒存储和释放的假说，表明它们主要存在于皮质，并可能通过非经典途径分泌。功能实验证实，AEA和RVD-血加压素能在肾上腺皮质细胞中调节类固醇激素前体孕酮的分泌，支持了它们在皮质中的潜在生理作用。此外，研究开发的新型VMAT2荧光探针CV-28为未来研究此类囊泡提供了有力工具。
这项研究的意义在于，它首次全面描绘了外周关键内分泌器官——肾上腺中ECS的生化地理图谱，将eCBs、肽类配体及其代谢酶与特定的肾上腺功能区联系起来，为理解ECS如何微调肾上腺应激反应（包括快速的儿茶酚胺释放和慢性的类固醇激素合成）奠定了分子基础。它挑战了先前关于pepcans产生部位的假设，推动了对其非经典生物合成与分泌机制的探索。对嗜铬颗粒代谢组的深入解析，不仅更新了我们对这些“激素储存罐”化学组成的认识，也为理解共传递现象提供了新线索。最终，这些发现强调了肾上腺内局部ECS信号的重要性，为靶向肾上腺ECS以治疗压力相关内分泌紊乱（如库欣综合征、嗜铬细胞瘤或某些形式的肾上腺功能亢进/不足）提供了新的理论依据和研究方向。
