miR-3099-5p 通过靶向 FACL4 改变小鼠肝细胞中的脂质水平并诱导线粒体功能障碍

《Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Basis of Disease》：miR-3099-5p alters cellular lipid levels and induces mitochondrial dysfunction by targeting FACL4 in mouse hepatic cells

糖尿病肝细胞中miR-3099-5p通过靶向FACL4调控线粒体功能与凋亡，揭示FACL4介导的脂质代谢紊乱是糖尿病肝损伤的重要机制。

　　

作者：Shalu Rathore、Ashima Rizvi、Radhika Kansal、Rajat Ujjainiya、Malabika Datta

印度新德里CSIR-基因组学与整合生物学研究所，Mall Road校区，邮编110007

摘要

内质网（ER）和线粒体的功能异常是由于线粒体相关内质网膜（MAM）位点上的连接蛋白水平失调所导致的，这是多种疾病的特征之一，然而人们对这些连接蛋白的调控机制知之甚少。在本研究中，我们利用小鼠肝细胞数据表明，miR-3099-5p能够结合到一种名为FACL4的MAM蛋白的3’非翻译区（3’UTR），并调节其细胞内的表达水平。糖尿病患者的miR-3099-5p水平升高，同时FACL4的水平降低。在小鼠Hepa1–6细胞中过表达miR-3099-5p可有效降低FACL4的水平，而miR-3099-5p抑制剂可以抑制这种效应。miR-3099-5p与FACL4的相互作用导致花生四烯酸积累减少，并影响其进入磷脂的过程。此外，虽然这种相互作用并未影响线粒体中的活性氧（ROS）或钙离子水平，但它改变了线粒体膜电位和线粒体通透性转换孔的开放情况，同时增加了细胞凋亡。单独抑制FACL4也能产生与miR-3099-5p过表达相似的效果，包括花生四烯酸积累、线粒体膜电位变化以及细胞凋亡的诱导。有趣的是，在Hepa1–6细胞中，花生四烯酸的过量积累足以引发细胞凋亡并损害线粒体膜电位；而补充花生四烯酸则显著逆转了miR-3099-5p抑制对细胞凋亡和线粒体膜电位的影响。这些发现表明FACL4介导了miR-3099-5p在小鼠肝细胞中的有害作用，研究这种miRNA对肝细胞中FACL4水平的影响可能有助于理解糖尿病期间的异常肝代谢过程。

引言

细胞代谢在专门的亚细胞器中受到高度调控和分隔，从而使真核细胞能够执行多种生物功能以维持正常的细胞稳态[1]。尽管这些亚细胞器在不同的细胞过程中扮演独立角色，但在它们紧密接触的特定部位也存在复杂的相互作用。其中最显著且研究最广泛的是内质网（ER）和线粒体之间的相互作用，这两种细胞的膜在称为MAM（线粒体相关内质网膜）的区域物理上可逆地连接在一起，使它们能够相互调节功能[2]。这些连接位点包含多种具有不同功能的蛋白质，对多种细胞过程至关重要，如线粒体动态、脂质运输、钙离子稳态、细胞凋亡和线粒体自噬[3][4][5]。内质网与线粒体之间的距离通常在10到25纳米之间[6]，但也有研究指出这一距离可达80纳米[7]。参与内质网-线粒体连接的蛋白质包括mitofusin（MFN）、葡萄糖调节蛋白75（GRP75）、磷酸富林酸酸性簇蛋白（PACS-2）、肌醇1,4,5-三磷酸受体（IP3R）、囊泡相关膜蛋白B（VAPB）、电压依赖性阴离子通道（VDAC）、长链脂肪酸酰基辅酶A合成酶4（FACL4）、磷脂酰丝氨酸合成酶1和2（PSS1,2）、sigma-1受体（Sig-1R）、线粒体分裂1蛋白（Fis1）以及蛋白质酪氨酸磷酸酶相互作用蛋白51（PTPIP51）[2][8][9][10]。 鉴于内质网-线粒体相互作用在调节多种细胞功能中的关键作用，其紊乱可能会导致多种细胞过程受损。越来越多的证据表明，内质网-线粒体通信的紊乱与多种疾病的发病和发展有关，包括糖尿病、癌症、与脂肪变性相关的代谢紊乱性肝病（MASLD）以及神经退行性疾病，如阿尔茨海默病（AD）、帕金森病（PD）和肌萎缩侧索硬化症（ALS）[7][11]。肥胖个体发生胰岛素抵抗的风险增加[12]。尽管这些关联背后的分子机制尚未完全明了，但异常的内质网和线粒体相互作用被认为是由营养过载引发的各种异常的关键因素[13]。 鉴于内质网-线粒体相互作用的重要性，许多研究集中在这一过程的调控因子上。microRNA（miRNA）已被认为是基因表达的重要调节者，它们通过精确调节目标mRNA的水平来调控生物过程。miRNA水平的改变与多种疾病相关，影响广泛的生理和病理细胞途径[14][15]。有趣的是，一些miRNA已知会影响内质网-线粒体接触位点的连接蛋白，从而影响这两种细胞器之间的通信。miR-7、miR-29a和miR-320a可以直接靶向VDAC1并影响其表达，从而影响内质网-线粒体通信[16][17][18]。miR-17-5p通过靶向并抑制MFN2的表达来促进心脏肥大[19]。miR-195通过靶向Mfn2导致2型糖尿病中的β细胞去分化及功能障碍，进而通过干扰PI3K/Akt信号通路损害线粒体，加剧β细胞衰竭[20]。miR-106b通过靶向对线粒体功能至关重要的Mfn2来调节骨骼肌中的胰岛素敏感性[21]。长链非编码RNA H19通过靶向VDAC1增强糖异生，并通过调节miRNA-106b-5p/酰基辅酶A合成酶长链家族成员4（ACSL4）轴来减轻脑出血造成的损伤[23]。此外，miR-20a-5p通过靶向FACL4 mRNA的3’非翻译区来抑制FACL4依赖的铁死亡，从而保护肾脏移植后的缺血-再灌注损伤[24]。在缺氧诱导的急性肺损伤模型中，miR-20b通过靶向MFN1和MFN2来减轻损伤，从而影响内质网-线粒体信号通路[25]。miR-153-5p靶向MFN1，破坏内质网-线粒体通信并促进线粒体碎片化[26]。GRP75是内质网-线粒体接触位点上的一个重要蛋白质，miR-200c在神经元损伤期间会靶向它，这会促进线粒体功能障碍并增加细胞对压力的敏感性[27]。其他miRNA如miR-449、miR-211、miR-670-3p、miR-130b-3p和miR-20a-5p直接靶向FACL4，并在癌症、心肌病和肾脏缺血等疾病中调节其表达[28][29][30][31][32]。尽管有这些报道，但在肥胖和糖尿病期间，非编码RNA在调节内质网-线粒体相互作用中的作用尚未完全明了。

在这项研究中，我们探讨了miRNA在调节MAM蛋白中的作用及其对糖尿病期间异常肝代谢的影响。

实验部分

动物实验

我们从印度新德里CSIR-IGIB的动物设施中获得了6至7周大的雄性C57BL6小鼠（共15只），并在无病原体的屏障设施中以12小时光照-黑暗周期饲养，提供自由的食物和水源。为了建立高脂肪饮食（HFD）小鼠模型，将小鼠随机分为两组：一组喂食高脂肪饮食（60%的热量来自脂肪，Research diet, Inc., USA），另一组喂食标准饲料（10%的热量来自脂肪，SCD）

高脂肪饮食会导致高血糖，并损害葡萄糖、胰岛素和丙酮酸的耐受性

我们首先按照补充图2A所示的方法建立了饮食诱导的糖尿病小鼠模型，并通过常规检测验证了该模型确实表现出葡萄糖耐受性和糖尿病的特征。与喂食标准饲料SCD的小鼠相比，喂食HFD的小鼠体重（补充图2B）和血糖水平（补充图2C）持续升高，持续时间为六个月。

讨论

本研究表明，在糖尿病期间，小鼠的肝FACL4水平受miR-3099-5p的调节，这进而影响Hepa1–6细胞中的脂质组成、线粒体功能和细胞凋亡。 蛋白质（即MAM）将内质网和线粒体紧密连接在一起，这种密切接触负责多种细胞功能，如钙信号传导、细胞凋亡、脂质交换、线粒体动态和细胞存活[41]。

作者贡献声明

Shalu Rathore：撰写初稿、方法论设计、实验实施、数据分析。 Ashima Rizvi：撰写初稿、方法论设计、数据分析。 Radhika Kansal：撰写初稿、方法论设计、数据分析。 Rajat Ujjainiya：方法论设计。 Malabika Datta：审稿与编辑、撰写初稿、项目监督、资金筹集、数据分析、概念构思。

作者贡献

M.D. 设计并实施了实验；S.R. 标准化了动物实验和miRNA实验；A.R. 和 R.K. 进行了花生四烯酸相关实验及miRNA模拟实验；R.U. 通过质谱法进行了脂质分析；S.R.、A.R.、R.K. 和 M.D. 分析数据并撰写了论文。

出版同意

所有作者均已阅读并批准了手稿。

伦理批准

本研究使用了动物，已获得印度新德里CSIR-基因组学与整合生物学研究所的机构动物伦理委员会（IAEC）的伦理批准，并符合印度新德里的实验控制和监督委员会（CPCSEA）的指导方针。

临床试验编号

不适用。

资金支持

本研究得到了印度新德里科学和工业研究委员会（Council of Scientific and Industrial Research, New Delhi）的支持。S.R. 和 R.K. 感谢印度新德里大学拨款委员会提供的奖学金。A.R. 和 R.U. 感谢印度新德里科学和工业研究委员会提供的奖学金。

利益冲突声明

无需要声明的利益冲突。

致谢

我们感谢CSIR-IGIB的动物设施和质谱设施的所有工作人员为实验提供的支持。