易聚集蛋白差异包涵体形成揭示神经元细胞系蛋白质稳态能力差异

《Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell Research》：Differential inclusion formation of an aggregation-prone protein reveals differences in the proteostasis capacity of neuronal cell lines

为揭示不同神经元细胞系应对蛋白质错误折叠和聚集的内在能力差异，研究人员利用双突变萤火虫荧光素酶FlucDM作为报告蛋白，比较了Neuro-2a与NSC-34细胞的蛋白质稳态能力。研究发现NSC-34细胞更易形成FlucDM包涵体，其蛋白质组学分析揭示了细胞类型特异性的蛋白质稳态网络参与模式，尤其内质网未折叠蛋白反应存在差异表达。该研究建立了定量评估细胞蛋白质稳态能力的平台，对理解神经元在蛋白质错误折叠疾病中的选择性易损性具有重要意义。

　　

在我们的身体细胞内部，一个精密而繁忙的“蛋白质工厂”时刻不停地进行着生产、折叠、运输和降解工作，这个维持蛋白质正常结构与功能平衡的体系被称为蛋白质稳态。一旦这个平衡被打破，蛋白质就可能错误折叠并聚集，形成被称为包涵体的蛋白质沉积物。这正是阿尔茨海默病、帕金森病和肌萎缩侧索硬化等多种神经退行性疾病的共同病理标志。然而，一个令人费解的现象是，许多具有聚集倾向的蛋白质在全身均有表达，但疾病相关的包涵体却特异性地出现在神经元和胶质细胞中。这表明，不同类型的细胞可能拥有不同的“防御能力”，即蛋白质稳态能力，来应对蛋白质聚集的威胁。那么，神经元及其相关细胞系的内在蛋白质稳态能力究竟有何差异？这种差异是否是导致神经元在蛋白质错误折叠疾病中表现出选择性易损性的关键？为了解答这些核心问题，Shannon McMahon、Dezerae Cox、Flora Cheng、Albert Lee、Justin.J. Yerbury和Heath Ecroyd等研究人员在《Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell Research》上发表了一项研究。

研究人员主要运用了以下关键技术方法：他们利用脂质体转染技术，将带有EGFP标签的野生型及双突变（R188Q， R261Q）萤火虫荧光素酶（Fluc^WT-EGFP和Fluc^DM-EGFP）质粒导入Neuro-2a（小鼠神经母细胞瘤细胞）和NSC-34（小鼠神经母细胞瘤×运动神经元杂交细胞）两种神经元细胞系。通过共聚焦显微镜手动计数和流式细胞术的脉冲形状分析（PulSA）技术，定量评估并比较了两种细胞系中Fluc包涵体的形成情况。为了探究包涵体的分子组成，研究人员通过NP-40裂解、差速离心和SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳）分离了不溶性组分，并从凝胶中切取了包含Fluc^DM包涵体的条带，进行凝胶内胰酶消化和反相液相色谱串联质谱（RP-LC-MS/MS）分析，从而鉴定出与包涵体共纯化的蛋白质。此外，还利用免疫印迹对部分质谱结果进行了验证，并基于已发表的两种细胞的全局蛋白质组数据，进行了基因本体（GO）映射分析，以比较其蛋白质稳态网络中关键通路（如分子伴侣、泛素-蛋白酶体系统、自噬、未折叠蛋白反应）的蛋白表达差异。

研究结果

3.1. 表达易聚集的Fluc^DM揭示NSC-34细胞比Neuro-2a细胞对包涵体形成具有更强的易感性

研究人员首先利用Fluc^DM的聚集倾向来测量和比较Neuro-2a与NSC-34细胞防止易聚集蛋白形成包涵体的相对能力。共聚焦显微镜观察发现，表达Fluc^DM-EGFP的两种细胞均能形成点状包涵体。

随后，通过流式细胞术的脉冲形状分析（PulSA）进行定量。PulSA利用EGFP荧光信号的脉冲宽度和高度差异来区分含有包涵体（信号窄而高）和蛋白可溶弥散（信号宽而低）的细胞。

分析显示，表达Fluc^DM的NSC-34细胞中含有包涵体的细胞比例显著高于Neuro-2a细胞。为了校正转染效率和蛋白表达量的差异，研究人员计算了PulSA聚集指数（含有包涵体的细胞百分比除以EGFP阳性细胞的几何平均荧光强度）。结果表明，NSC-34细胞的Fluc^DM聚集指数显著更高，说明其防止Fluc^DM聚集的能力较弱。

进一步，研究人员将细胞根据EGFP荧光强度分为16个区间，分析在每个表达量区间内形成包涵体的细胞比例。

结果显示，随着Fluc表达量的增加，两种细胞中形成包涵体的细胞比例均上升，但NSC-34细胞在较低的Fluc^DM表达水平（如区间12和13）就开始出现较高比例的包涵体，而Neuro-2a细胞则需要更高的表达量。这定量地证实了NSC-34细胞对Fluc^DM聚集的敏感性更高。

3.2. Fluc^DM包涵体的蛋白质组学分析揭示了蛋白质稳态机制与聚集蛋白的细胞类型特异性结合

为了探究NSC-34细胞对Fluc聚集易感性增加的分子驱动因素，研究人员分析了两种细胞系中Fluc^DM包涵体的组成。通过SDS-PAGE分离不溶性蛋白，由于分子量巨大，Fluc^DM包涵体被截留在浓缩胶中，通过凝胶荧光成像可被定位。DM包涵体中鉴定蛋白质的KEGG通路富集和类别分析。(A) 488 nm光激发下显示EGFP荧光的SDS-PAGE凝胶，箭头指示被截留在浓缩胶中的Fluc^DM包涵体。">

从凝胶中切取相应条带进行质谱分析，共鉴定出676种蛋白质。其中241种（35.7%）在两种细胞系中均存在，259种（38.3%）为Neuro-2a细胞特有，176种（26.0%）为NSC-34细胞特有。

KEGG（京都基因与基因组百科全书）通路富集分析显示，与神经退行性疾病（阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病、肌萎缩侧索硬化等）相关的通路在两种细胞的包涵体中均显著富集。其他高度富集的通路包括转录、翻译、细胞周期控制、呼吸代谢，以及蛋白质稳态网络的关键分支，如蛋白酶体降解和内质网中的蛋白质加工。PANTHER（通过进化关系进行蛋白质注释）蛋白类别分析也显示，代谢酶、RNA结合蛋白（如翻译机制相关蛋白）、细胞骨架蛋白、转运蛋白和分子伴侣是两类细胞包涵体中最具代表性的蛋白类别。

对蛋白质互作网络的STRING（检索相互作用基因/蛋白质的搜索工具）分析表明，尽管主要蛋白类别相似，但具体互作蛋白在两种细胞间存在差异。DM包涵体内蛋白质的STRING分析和相对丰度。">

值得注意的是，与内质网加工相关的蛋白仅在Neuro-2a细胞的包涵体中被鉴定到。研究人员通过免疫印迹验证了质谱结果，确认热休克蛋白90（Hsp90）在两种细胞的包涵体中均存在，热休克蛋白105（Hsp105）特异性地与Neuro-2a细胞的包涵体结合，而热休克蛋白40家族成员DnaJB6则在NSC-34细胞的包涵体中含量更高。

3.3. Neuro-2a和NSC-34细胞蛋白质组的基因本体分析揭示了蛋白质稳态网络中内质网未折叠蛋白反应组分的差异表达

为了探究两种细胞在基础状态下蛋白质稳态网络是否存在固有差异，研究人员利用已发表的两种细胞的全局蛋白质组数据进行了基因本体（GO）映射分析。对整个蛋白质组（4325种蛋白质）的分析显示，Neuro-2a和NSC-34细胞中蛋白质的表达量高度线性相关，表明两者整体蛋白质组非常相似。

随后，研究人员聚焦于与蛋白质稳态网络关键分支相关的GO术语，包括“分子伴侣”、“泛素-蛋白酶体系统”、“自噬”和“未折叠蛋白反应”。分析发现，前三个分支在两种细胞中的表达分布与全局蛋白质组相比无显著差异。

然而，与“未折叠蛋白反应”相关的蛋白质，其表达相关性虽高，但其分布与全局蛋白质组相比呈现左偏趋势。进一步针对特定术语“GO:0030968（内质网未折叠蛋白反应）”的分析发现，其18种相关蛋白的表达分布在两种细胞间存在显著差异（P = 0.04）。这一结果表明，Neuro-2a和NSC-34细胞的内质网未折叠蛋白反应通路存在差异表达，这可能是导致两者对Fluc^DM包涵体形成倾向不同的原因之一。

研究结论与意义

本研究成功利用易聚集的Fluc^DM蛋白定量揭示了NSC-34细胞比Neuro-2a细胞对蛋白质聚集诱导的包涵体形成更为敏感，其蛋白质稳态能力相对较弱。所建立的基于PulSA的聚集指数和表达量-包涵体形成关系分析，为定量比较不同细胞类型的蛋白质稳态能力提供了一个有效框架。

对包涵体的蛋白质组学分析表明，尽管两种细胞系包涵体中的主要蛋白质类别高度相似，均富含翻译机制、分子伴侣、蛋白酶体组分等蛋白质稳态网络的核心元件，但具体结合的蛋白质存在细胞类型特异性。这凸显了蛋白质质量控制通路在维持细胞内蛋白质可溶性方面的重要作用。特别重要的是，基因本体分析发现，内质网未折叠蛋白反应通路在两种细胞中的表达调控存在显著差异，这可能是解释其聚集易感性不同的关键分子基础。内质网是负责分泌蛋白和膜蛋白正确折叠的关键场所，其稳态失衡与神经退行性疾病密切相关。

综上所述，这项研究不仅建立了一个评估细胞蛋白质稳态能力的定量平台，强调了细胞类型背景在蛋白质组维持中的重要性，而且通过鉴定与聚集蛋白相互作用的特异性通路，为理解神经元在蛋白质错误折叠疾病中表现出的选择性易损性提供了新的分子见解。识别出防止蛋白质聚集的关键通路，结合能够评估细胞对包涵体形成易感性的技术，为开发针对神经退行性疾病的有效疗法奠定了基础。