《Bioelectrochemistry》：Parameter-dependent modulation of cardiomyocyte metabolic activity by microsecond circular pulsed electric fields
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心肌细胞代谢活性与存活率受μsPEFs电压、脉冲包数及应用次数影响，低电压（≤1400V）24小时后代谢恢复，高电压（≥1600V）引发双相代谢抑制及显著细胞死亡。
Xianjin Hu|Zexi Li|Wenjie Li|Bangjiaxin Ren|Fanghui Li|Aobo Gong|Ying Cao|Yifan Zhou|Rui Zeng
中国四川大学华西医院心脏病科
摘要
脉冲场消融（PFA）是一种新兴的心律失常治疗方法，但不同微秒级脉冲电场（μsPEFs）参数对心肌细胞代谢活动和存活率的影响尚未完全明了。本研究旨在系统探讨电压强度、脉冲包数量和应用次数如何影响心肌细胞的代谢活动和存活率。AC16人源心肌细胞被暴露于不同电压、脉冲包数量和应用次数的μsPEFs中。通过CCK-8检测在干预后多个时间点评估代谢活动，利用Annexin V-FITC/PI流式细胞术分析细胞死亡情况。低电压μsPEFs（≤1400 V）仅引起轻微的代谢抑制，并在24小时后部分恢复；高电压（≥1600 V）则导致代谢反应呈双相变化，6小时时达到峰值，24小时后急剧下降。随着脉冲包数量和应用次数的增加，特别是在高电压下，代谢抑制逐渐加剧。流式细胞术显示凋亡和坏死心肌细胞数量随电压增加而增加，且在≥1600 V时存活率显著下降。心肌细胞的代谢活动和存活率对μsPEFs参数表现出明显的剂量依赖性，存在不可逆损伤的电压和能量阈值。精确调节μsPEFs参数对于优化治疗效果和安全性至关重要。这些发现为未来的μsPEFs消融临床前和临床研究提供了依据。
引言
导管消融通过个性化手术为心律失常管理提供了一种定制化的治疗方法[1]、[2]。目前的消融策略主要利用热能[3]、[4]、[5]。尽管热消融通过蛋白质变性实现组织破坏，但其非特异性的热损伤仍可能导致膈神经损伤、食管瘘和肺静脉狭窄等风险[6]、[7]、[8]、[9]。脉冲场消融（PFA）通过施加微秒级电场（μsPEFs）来诱导电穿孔这一非热机制，从而选择性地作用于心肌细胞膜[10]、[11]、[12]。PFA在临床上的快速应用得益于其无与伦比的组织选择性，这大大减少了心脏外并发症[13]、[14]。虽然纳秒级脉冲技术最近已进入临床试验阶段，但μsPEFs已在临床中得到广泛应用，因此迫切需要优化这些具有临床意义的参数[15]。此外，现代临床系统主要采用双相波形，与单相脉冲相比，双相波形能显著减轻骨骼肌收缩和术中疼痛[16]，从而提高手术安全性。
电穿孔通过纳米级膜缺陷引发细胞死亡，但其后续的代谢后果，尤其是线粒体功能障碍和ATP耗竭，在决定细胞死亡方式中起着关键作用[17]。ATP耗竭通常由钙超载和线粒体功能障碍引起，它在将细胞死亡方式从凋亡转变为坏死的过程中起着关键作用[18]、[19]。CCK-8检测通过WST-8的脱氢酶介导的还原反应来量化细胞代谢活动。由此产生的吸光度变化间接反映了糖酵解通量和线粒体功能状态[20]。关于能量传递策略，最新研究表明，分阶段脉冲训练可以提高心肌细胞膜的通透性并降低致死剂量阈值[21]。尽管有研究表明电穿孔后的细胞死亡是一个依赖于脉冲强度的动态过程[22]，但系统量化参数依赖的代谢变化及其时间动态仍需进一步研究。深化这些知识将有助于开发出具有最小脱靶效应的优化能量剂量策略。
本研究旨在量化不同脉冲参数下心肌细胞代谢活动的变化，并描述24小时内代谢抑制的时间演变过程。
实验部分
细胞培养
AC16人源心肌细胞（武汉PriCells生物医学技术有限公司提供）在添加了10% FBS和1%青霉素-链霉素的完全DMEM/F-12培养基中培养，培养条件为37°C和5% CO?。细胞在80%汇合度时使用0.25%胰蛋白酶-EDTA进行传代。实验时，细胞被收集并重新悬浮在新鲜培养基中，最终密度为1×10^5细胞/mL。脉冲电场系统
双相微秒脉冲由AccuBlator?多通道PFA发生器和AccuPulse圆形导管产生并传递电压依赖性和时间分辨的代谢变化
AC16心肌细胞在暴露于μsPEFs后表现出明显的时间依赖性代谢反应，这种反应随施加电压的不同而变化（图4A-D）。在1400 V时（图4A），代谢活动随时间逐渐增加，24小时时的增加幅度显著（88.7%±9.2% vs 76.1%±9.7%，p<0.001），表明在亚致死能量水平下细胞有所恢复。相比之下，较高电压（1600–2000 V）引起了双相代谢反应：初始阶段代谢活动上升
讨论
本研究探讨了电压强度、脉冲包数量和μsPEFs应用次数对心肌细胞代谢活动和细胞死亡的影响。通过系统分析不同实验条件下的细胞存活率、坏死和凋亡情况，我们试图明确μsPEFs暴露与心肌细胞损伤之间的剂量-反应关系。研究结果表明，低电压μsPEFs对心肌细胞代谢活动的影响较小
结论
本研究表明，心肌细胞的代谢活动和存活率受到μsPEFs电压和能量剂量的显著影响，存在不可逆损伤的明确阈值。精确控制μsPEFs参数对于最大化消融效果同时最小化组织损伤至关重要。这些发现为未来μsPEFs临床前和临床研究的方案优化奠定了基础。
作者贡献声明
Xianjin Hu：撰写——审稿与编辑、撰写——初稿、数据可视化、方法学研究、数据分析。Zexi Li：撰写——审稿与编辑、撰写——初稿、数据分析。Wenjie Li：数据可视化、方法学研究。Bangjiaxin Ren：数据可视化、方法学研究。Fanghui Li：数据分析。Aobo Gong：数据分析。Ying Cao：数据分析。Yifan Zhou：数据分析。
资助
本研究得到了
四川省科学技术厅（资助编号：2024YFFK0046）和
四川大学华西医院（资助编号：2023HXFH002）的支持。资助方未参与研究设计、数据收集与分析、发表决定或手稿准备。
未引用参考文献
[20]
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能影响本文工作的财务利益或个人关系。
致谢
作者感谢AccuPulse Medical Technology Ltd.（中国苏州）提供本研究中使用的AccuBlator?多通道PFA发生器和AccuPulse圆形PFA导管。
