《Bioelectrochemistry》：Surface activation and functionalization with aryl-diazonium chemistry enable biomolecules grafting on 3D printed carbon-based electrodes
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为解决3D打印碳基电极（FDM-PLA/CB）生物受体固定困难、流程复杂的问题，研究人员开发了一种基于电化学接枝4-羧基苯重氮盐（4-CP diazonium）的表面功能化策略，结合O2等离子体或NaOH预处理，显著提升了电极表面的羧基密度与生物分子接枝效率，为低成本、高性能的电化学生物传感器（如aptasensor）提供了新途径。
在追求个性化、低成本医疗检测和即时诊断（point-of-care testing, POCT）的时代，3D打印技术，特别是熔融沉积成型（Fused Deposition Modelling, FDM），为快速制造定制化电化学传感器件带来了革命性希望。想象一下，实验室可以根据需求，像打印一个玩具模型一样，“打印”出形状、尺寸各异的电极，用于检测特定的病毒、细菌或生物标志物。然而，这个美好的愿景面临着一个现实的“拦路虎”：如何将那些具有精准识别能力的生物分子（如抗体、DNA或适配体）稳定且高效地固定在打印出来的电极表面上？传统的3D打印碳基电极，通常使用碳黑（Carbon Black, CB）和聚乳酸（Polylactic Acid, PLA）的复合材料。虽然PLA成本低廉、生物相容性好，但它是一种绝缘体，会包裹住导电的碳黑颗粒，导致电极表面电化学活性差，更关键的是，其表面缺乏足够的、可与生物分子发生共价连接的活性官能团（如羧基）。因此，直接在这些“原始”电极上固定生物受体，往往效率低下，且生物分子的活性和稳定性难以保证。现有的方法要么依赖昂贵复杂的纳米材料（如金纳米颗粒、氧化石墨烯）修饰，要么需要从头定制含有功能化碳材料的打印线材，这些都限制了技术的普及和应用。
发表在《Bioelectrochemistry》上的这项研究，正是为了破解这一难题。研究团队提出并验证了一种巧妙且普适的策略：首先对商业化的PLA/CB 3D打印电极进行表面“激活”，去除绝缘的PLA层并暴露、活化碳材料；然后，利用成熟的芳基重氮盐（aryl diazonium salt）电化学接枝技术，在活化的电极表面“种植”上高密度的羧基（-COOH）；最后，通过这些羧基，利用碳二亚胺（EDC/NHS）化学，将带有氨基（-NH2）的生物分子（如模型分子氨基甲基二茂铁和针对蜡样芽孢杆菌的适配体）共价固定上去。这项研究不仅证实了该策略的可行性，更通过系统对比，揭示了不同表面预处理方法（电化学NaOH循环 vs. O2等离子体处理）对最终生物分子固定效果的深远影响。
为了完成这项研究，作者们主要运用了以下几项关键技术：1. 电极设计与3D打印：使用SolidWorks设计圆盘电极模型，通过Cura软件切片，采用双喷头3D打印机，分别用PLA和PLA/CB复合线材打印电极支撑体和导电部分。2. 电极表面活化：对比研究了两种预处理方法——在1 M NaOH溶液中进行电化学循环扫描，以及使用微波O2等离子体处理。3. 表面表征技术：采用扫描电子显微镜（SEM）和原子力显微镜（AFM）分析表面形貌与粗糙度；通过纳米红外光谱（nanoIR spectroscopy）和接触角测量分别表征表面化学组成和亲疏水性。4. 电化学功能化与表征：利用循环伏安法（CV）在酸性条件下原位生成4-羧基苯重氮盐（4-CP diazonium）并进行电化学接枝；使用CV和电化学阻抗谱（EIS）评估电极的电化学性能及每一步修饰后的界面变化。5. 生物分子固定与验证：采用EDC/NHS化学将模型探针分子（氨基甲基二茂铁，Fc-CH2NH2）和目标生物分子（靶向蜡样芽孢杆菌的氨基化适配体SP15S2-NH2）共价固定到羧基化表面，并通过CV定量接枝密度，通过EIS和荧光显微镜（使用罗丹明标记的互补链进行杂交）验证适配体的成功固定与可及性。
研究结果
3.1. 电极的表征
热重分析-红外联用（TGA-IR）确认了商用PLA/CB线材的成分和热分解行为。拉曼光谱（Raman spectroscopy）在电极表面检测到碳黑的特征D峰和G峰，且ID/IG比值为1.07，表明碳黑在PLA中分布均匀。
3.2. 处理对电极表面性质的影响
3.2.1. 对表面粗糙度和亲水性的影响
SEM和AFM图像显示，无论是NaOH处理还是O2等离子体处理，都显著增加了电极表面的粗糙度，形成了孔洞和突起。O2等离子体处理后的表面粗糙度（RMS=201 nm）远高于NaOH处理（RMS=120 nm）。接触角测量表明，未处理电极表面呈弱亲水性（接触角86°），NaOH处理后变得高度疏水（接触角131°），而等离子体处理后表面变得极度亲水（接触角无法测量）。
3.2.2. 对表面化学的影响
纳米红外光谱分析揭示了表面化学组成的变化。未处理电极显示强烈的PLA特征峰（如~1750 cm-1处的羰基C=O伸缩振动）。NaOH处理后，PLA特征峰减弱或消失，出现了归属于碳黑芳香结构、环氧基、醇C-O键等的吸收峰。O2等离子体处理后，光谱显示在~1736 cm-1和1588 cm-1处出现了羧酸基团的强吸收峰，证实了表面生成了大量含氧极性官能团，这与极高的亲水性相符。
3.2.3. 电极电化学性能评估
使用[Fe(CN)6]3?/4?氧化还原探针进行的CV测试表明，两种处理都极大增强了电极的电化学响应。O2等离子体处理电极的电流响应是NaOH处理电极的两倍，其电化学活性面积（0.59 cm2）接近几何面积，是NaOH处理电极（0.23 cm2）的2.6倍，这归因于等离子体处理更有效地去除了PLA、增加了粗糙度并引入了含氧官能团。
3.3. 基于重氮化学的电极功能化
3.3.1. 通过4-CP重氮盐电接枝进行功能化
在活化的电极表面，通过电化学还原原位生成的4-羧基苯重氮盐（4-CP diazonium），成功接枝了羧基官能团。CV监测显示，在第一个扫描周期出现了典型的重氮盐不可逆还原峰，且峰面积在等离子体处理电极上更大，表明接枝密度更高。随后的扫描峰电流下降，证实了接枝层的形成。用[Fe(CN)6]3?/4?探针测试发现，接枝后电极响应电流下降（“阻塞效应”），且在等离子体处理电极上该效应更明显，说明其接枝层更均匀致密。
3.3.2. 氨基甲基二茂铁（Fc-CH2NH2）在羧基化表面的接枝
通过EDC/NHS化学将模型分子Fc-CH2NH2共价连接到羧基化表面，利用CV量化二茂铁的表面覆盖度（Γ）。结果表明，经过4-CP修饰后，两种电极的Fc接枝密度都显著增加。更重要的是，O2等离子体预处理结合4-CP接枝，使得Fc-CH2NH2的接枝密度比仅用等离子体处理时提高了6.5倍，而NaOH处理的电极仅提高了2.4倍。在最高测试浓度下，等离子体处理电极的Γ值（9.05 × 10-9mol/cm2）远高于NaOH处理电极（1.34 × 10-9mol/cm2），也高于理论单层密度的计算值，这归因于电极表面粗糙度高以及可能形成了多孔多层接枝结构。
3.3.3. NH2功能化SP15S2适配体的接枝
将相同的策略应用于靶向蜡样芽孢杆菌的氨基化适配体（SP15S2-NH2）的固定。EIS分析显示，两种预处理电极在活化后电荷转移电阻（Rct）大幅下降，经4-CP修饰后Rct上升，而接枝适配体后Rct再次显著下降。Rct的降低通常归因于带负电的羧酸盐被中性或带负电但排列不密集的生物分子部分中和，减少了与[Fe(CN)6]3?/4?探针的静电排斥。荧光显微镜成像使用罗丹明标记的互补链进行杂交验证，结果显示在接枝了适配体的电极表面观察到强烈的特异性荧光信号，而在阴性对照（仅4-CP修饰，未接枝适配体）上几乎没有荧光，证明了适配体的成功、特异性固定以及其生物识别能力的保留。
结论与讨论
本研究成功论证了利用芳基重氮化学对基于商业化PLA/CB线材的3D打印电极进行表面功能化的有效策略。研究的关键发现在于，不同的表面预处理方法对最终功能化效果有决定性影响。O2等离子体处理在去除PLA绝缘层、增加表面粗糙度和引入大量含氧极性官能团（尤其是羧基）方面显著优于电化学NaOH处理，从而创造了更亲水、更具反应活性的表面。这使得后续的4-羧基苯重氮盐电化学接枝更为高效，形成了更高密度的羧基接枝层。通过模型分子Fc-CH2NH2的定量接枝实验证实，等离子体预处理结合重氮化学修饰，能将氨基分子的接枝效率提升约一个数量级。最终，通过EDC/NHS化学成功将具有生物识别功能的适配体共价固定在功能化电极表面，并经EIS和荧光杂交实验验证了其可及性和活性。
这项工作的意义在于，它提供了一种相对简单、低成本且高效的方法，来克服3D打印碳基电极在生物传感应用中的一个核心瓶颈——生物受体的稳定固定。该方法不依赖于复杂的纳米材料修饰或定制化功能线材，直接对现有商业线材打印的电极进行后处理即可实现高性能生物接口的构建。通过调控预处理（如选择等离子体处理）和接枝参数，可以精细调控电极表面的化学性质和粗糙度，从而为开发新一代低成本、可定制、高性能的3D打印电化学生物传感器（如适配体传感器，aptasensor）铺平了道路。这不仅推动了3D打印在分析化学和生物传感领域的应用，也为即时诊断和个性化医疗设备的开发提供了新的技术可能性。
