《Proceedings of the National Academy of Sciences》：GSK-3β coordinates axonal microtubule organization through Shot and Tau
GSK-3β通过Shot和Tau协调轴突微管组织
意义
糖原合酶激酶3β（GSK-3β）是神经元发育的关键调节因子，并与多种神经退行性和神经发育疾病相关。然而，其活性如何与神经元发育和维持相联系的细胞机制尚不清楚。本研究发现，GSK-3β通过调节微管调节因子Shot和Tau的双重作用来维持轴突微管束。破坏这种平衡（无论是通过激酶过度激活还是抑制）都会导致微管病理性解束，损害轴突完整性。这项工作揭示了GSK-3β在组织神经元细胞骨架中的基本作用，对GSK-3β发挥作用的多种细胞类型和背景具有广泛意义。我们的发现可能有助于解释为何广泛的GSK-3β抑制在治疗环境中显示出有限的成功。
摘要
GSK-3β是神经元发育和维持的关键协调者；过度活跃的GSK-3β与神经发育和退行性疾病相关，因此是一个有前景的治疗靶点。在神经元中，GSK-3β通过磷酸化微管结合蛋白来协调细胞骨架。在这项研究中，我们发现，果蝇和大鼠轴突中平行微管束的维持需要GSK-3β激酶活性的严格调节。GSK-3β的上调或下调导致轴突形成病理性肿胀，其中微管束分解成无序、卷曲的微管。我们确定了微管成束蛋白Shot和Tau是关键的GSK-3β靶点，并发现GSK-3β通过它们发挥其对微管成束的调节作用。GSK-3β调节Shot和Tau附着于微管和/或Eb1的能力。GSK-3β的失调导致Eb1–Shot介导的聚合微管引导进入平行束的丢失，从而引起解离。我们提出，在GSK-3β的活性和非活性状态下，微管解离将其过度活跃与神经退行性联系起来，并可能解释为何全球性GSK-3β抑制在临床试验中失败。
引言
轴突的发育和维持关键依赖于平行微管束。微管建立轴突投射，适应神经元细胞形状，并且是运动蛋白运输囊泡和其他货物的底物。微管聚合和稳定性的调节对于微管束的形成至关重要，而这一过程的破坏，如微管丢失或解离，是许多轴突病理学的共同特征。尽管具有生理重要性，维持微管束的分子机制尚未完全明了。
激酶GSK-3β已成为微管稳定性和动力学的关键调节因子。GSK-3β是正常神经元发育所必需的，其失调与几种神经发育和退行性疾病有关。因此，GSK-3β是神经系统疾病的一个有前景的治疗靶点。然而，全球性GSK-3β抑制要么没有治疗益处，要么导致长期毒性（例如已批准的抑制剂锂）和神经元衰退，这表明GSK-3β调节的复杂性尚未被充分认识。
在这里，我们测试了GSK-3β的失调是否影响来自基因易处理的果蝇和大鼠海马原代神经元培养物中的轴突微管束。我们发现，GSK-3β的失调（包括过度活化和失活）破坏了平行微管束的组织。我们确定了两个关键的微管相关蛋白，即spectraplakin Short Stop (Shot)和Tau，它们是正常微管成束所必需的GSK-3β靶点。这两种蛋白质在维持微管束中发挥重要作用。
我们发现，GSK-3β的过度活化通过减少Tau与微管的结合导致微管解束，这破坏了Shot/Eb1介导的聚合微管对齐成平行束。相反，GSK-3β失活使微管-肌动蛋白交联蛋白Shot从正端脱离。这阻止了Shot引导聚合微管形成适当的束。GSK-3β介导的关键微管调节因子的这些差异效应及其对微管束维持的影响，是解释GSK-3β过度和低磷酸化如何引起病理学的模型。此外，这一框架解释了为何全球性GSK-3β抑制对神经退行性疾病几乎没有治疗效果。
结果
dGSK-3β的激活和失活导致果蝇原代神经元轴突微管解离
为了评估GSK-3β在轴突微管组织中的作用，我们在培养的神经元中表达组成型活性或显性失活的果蝇GSK-3β（dGSK-3β或Shaggy）突变体，并分析微管组织。原代神经元来自过表达组成型活性dGSK-3β（CA，UAS-sggCA，S9A突变）或显性失活、激酶死亡（UAS-sggDN；A81T突变）的果蝇品系的胚胎。体外培养6小时后，固定神经元并用抗微管蛋白抗体染色以可视化微管。dGSK-3β的激活或抑制导致轴突肿胀，其中微管失去其束状构象并变得卷曲。我们使用先前描述的微管解离指数量化了这种表型。测量结果为sggCA的MDI为1.8，sggDN为2.1。为了独立验证dGSK-3β失活对微管组织的影响，我们培养了来自具有dGSK-3β功能丧失等位基因的动物神经元，或用增加浓度的GSK-3β抑制剂锂处理野生型神经元。两种处理均导致微管解束显著增加。
为了确定dGSK-3β在微管组织中的作用是否超出早期生长锥阶段，我们分析了体外培养三天后表达sggCA或sggDN的神经元。较老的神经元在两种条件下均表现出微管卷曲增加。来自幼虫大脑培养的神经元在表达sggCA和sggDN时也表现出显著解束。
我们接下来分析改变dGSK-3β水平是否在成熟神经元中诱导微管解束，使用RU486诱导的Gal4/UAS表达。神经元在没有诱导的情况下成熟三天，达到后生长锥阶段，形成突触前，然后加入RU486诱导24小时。对照显示最小的解离，而sggCA和sggDN显著增加微管解束。作为正交方法，我们用GSK-3β抑制剂锂处理培养三天的神经元24小时。10 mM锂处理导致微管解离相对于载体处理的神经元增加2.3倍，与组成型活性dGSK-3β的表达相当。
总之，这些结果表明，dGSK-3β激酶活性的增加和减少都会导致微管解离。因此，平衡的GSK-3β激酶活性是在生长和成熟神经元中维持微管网络所必需的。
hGSK-3β介导的调节是维持哺乳动物神经元微管组织/成束所必需的
为了探讨这一观察是否普遍适用，我们确定了人GSK-3β（hGSK-3β）的失调是否影响培养的大鼠海马神经元中的微管组织。我们在铺板前用组成型活性或显性失活的hGSK-3β质粒电转神经元。神经元在培养一天后固定，并用抗α-微管蛋白和HA抗体染色。在培养一天时，大多数神经元处于发育阶段2，已延伸次要神经突，但尚未极化和分化轴突和树突。组成型活性和显性失活hGSK-3β的表达导致微管解离显著增加。
为了测试hGSK-3β是否在成熟神经元中维持微管组织，我们在培养六天后用组成型活性或显性失活的GSK-3β转染海马神经元，24小时后固定。在培养七天时，神经元完全极化，具有发育的轴突和树突。两种构建体均显著增加微管解离。树突MDI分别上升4.6倍和3.9倍。我们无法计算轴突的MDI，因为七天神经元的轴突显著延伸超出视野，而整个轴突长度是MDI的必要参数。相反，我们计算了每个视野中具有解离微管的轴突百分比，并观察到从未处理神经元的13%增加到44%（GSK-3βCA）和40%（GSK-3βDN）。
这些实验表明，我们在果蝇中修改dGSK-3β活性后看到的效果在哺乳动物神经元中得以重现。因此，平衡的GSK-3β活性是维持微管束所必需的，这是一个保守的特征，很可能是维持神经元细胞骨架的普遍机制。
dGSK-3β差异性影响Eb1彗星形成
Eb1是协调微管动力学的主要调节因子，它与生长中的微管结合，并作为支架将其他蛋白质招募到微管尖端。我们先前发现，微管束排列与微管正端Eb1的可用性紧密相关，因为Eb1彗星大小与微管卷曲之间存在负相关：较小的Eb1彗星导致较大的MDI值。因此，我们测试了GSK-3β过度活化或失活是否会耗尽微管正端的Eb1。
我们培养了表达组成型活性或显性失活dGSK-3β的胚胎或幼虫神经元，并通过免疫染色确定了微管正端的Eb1量。在胚胎和幼虫神经元中，sggCA使正端的Eb1减少，而sggDN仅有轻微影响。胚胎神经元在尖端显示出较高的Eb1，而在幼虫神经元中没有变化。为了评估过度活跃或失活的dGSK-3β是否影响Eb1表达，我们使用实时RT-PCR比较了表达elav驱动的UAS-GFP、UAS-sggCA或UAS-sggDN的L3游走阶段大脑中的Eb1 mRNA水平。条件之间未观察到Eb1水平的显著差异。
为了测试GSK-3β操作在哺乳动物神经元中是否具有可比效应，我们共表达活性hGSK-3βCA或失活hGSK-3βDN与EB3-GFP，固定细胞并对GFP染色。我们未观察到表达hGSK-3βDN的神经元中彗星长度的差异。然而，hGSK-3βCA导致彗星尺寸减少。
这些实验表明，微管正端Eb1的丢失可以解释由GSK-3βCA表达引起的微管解束，但不能解释GSK-3βDN引起的解束。这表明，由GSK-3β过度活化或失活诱导的微管解离表型是由不同机制引起的。
dGSK-3β过度活化通过Tau丢失导致微管解离
微管相关蛋白Tau是GSK-3β磷酸化靶点。磷酸化后，Tau从微管上脱离，而Tau从微管上的丢失导致微管正端Eb1减少，从而导致微管解束。我们假设，GSK-3β过度活化通过磷酸化Tau和随后的Tau从微管脱离而引起微管解离。
为了测试GSK-3β活性是否影响Tau与轴突微管的关联，我们在两个内源性Tau被GFP标记的独立果蝇品系中表达过度活跃的sggCA或失活的sggDN，培养神经元并进行活细胞成像。在对照中，Tau-GFP定位于轴突微管，但sggCA表达使其减少，而sggDN没有影响。Tau mRNA水平未改变，表明dGSK-3β过度活化将Tau从轴突微管上置换，支持了GSK-3β过度活跃通过Tau失调破坏微管的假设。
为了测试dGSK-3β和Tau是否在同一通路中起作用，我们使用tau杂合果蝇进行遗传相互作用实验，并测量微管解离。tau杂合本身没有影响，而sggCA增加解离。这在tau杂合神经元中强烈增强。sggDN也增加解离，但这不受tau减少的进一步影响。这些结果支持sggCA（而非sggDN）与tau在遗传上相互作用，表明它们可能在同一通路中起作用。
为了确定dGSK-3β介导的微管解离是否依赖于Tau，我们在两个独立的tau功能丧失果蝇品系中表达sggCA，并测量微管解离。如果sggCA通过tau起作用，那么其在纯合tau神经元中的表达不应增加解离。事实上，在纯合低效tau突变体中，sggCA表达几乎没有影响。相反，在tau神经元中表达sggDN增加微管解离。
我们先前证明，Tau的丢失导致Eb1与微管晶格的结合增加，以及生长微管尖端Eb1的丢失。正端Eb1的丢失导致微管卷曲，因为它降低了肌动蛋白-微管交联蛋白Shot引导生长微管进入平行束的能力。为了确定过度活跃的dGSK-3β是否通过Eb1从微管尖端重新定位到轴而引起微管解束，我们在野生型、sggCA或sggDN表达神经元中对Eb1染色，并测量微管轴上的Eb1。我们发现，sggCA表达导致微管轴上Eb1增加。sggDN表达未改变微管轴上的Eb1水平。
在tau突变体中，通过过表达Eb1-GFP增加Eb1水平可以将Eb1恢复到正端并挽救微管卷曲。因此，我们询问Eb1-GFP过表达是否可以挽救由sggCA引起的微管解离表型。当共表达Eb1-GFP时，sggCA的表达不会引起微管解离。这种挽救是Eb1特异性的，因为共表达另一种蛋白质的正端结合结构域和sggCA仍然导致微管解离。这表明dGSK-3β过度活化通过Tau和Eb1引起微管解离。
Shot和失活dGSK-3β在同一通路中起作用导致微管解束
微管成束的关键介质是spectraplakin Short Stop (Shot)，它通过交联皮层肌动蛋白和Eb1来引导聚合微管进入平行束。因此，Shot是dGSK-3β失调引起微管解离的合理靶点。
为了测试dGSK-3β和shot是否在同一通路中起作用，我们减少shot表达并测量微管解离。shot杂合神经元与野生型没有差异，表明减少shot足以成束。然而，sggCA和sggDN的表达在shot杂合神经元中更大程度地增加解离。为了进一步评估sggDN对Shot的依赖性，我们在纯合shot神经元中表达GSK-3β。shot缺失本身引起严重解离，sggCA和sggDN均未进一步增加。这些观察表明，Shot和dGSK-3β在同一通路中起作用。
GSK-3β在Shot的Eb1/微管结合区磷酸化Shot
我们发现sggCA或sggDN不影响shot表达，因此评估了GSK-3β是否可以直接调节Shot。GSK-3β磷酸化特定共有基序的丝氨酸/苏氨酸残基。在哺乳动物Shot同源物ACF7中，GSK-3β磷酸化遵循这种模式的一系列丝氨酸簇。它们位于C端微管结合结构域和Eb1蛋白结合SxI/LP位点之间。我们通过序列分析在Shot的C端确定了可比的假定GSK-3β磷酸化位点簇。
为了确定GSK-3β是否磷酸化这些残基，我们生成了野生型簇和丝氨酸-丙氨酸突变体的GST标记肽段，以及已知被GSK-3β磷酸化的MAP1B肽段作为阳性对照。我们在GSK-3β硫代磷酸化测定中测试了这些肽段。我们使用hGSK-3β，因为果蝇和哺乳动物GSK-3β显示出高度的结构和功能保守性，并且激酶及其靶点可以互换使用。我们观察到最小的GST磷酸化、强烈的MAP1B磷酸化和实质性的野生型Shot磷酸化。丝氨酸-丙氨酸突变体未被有效磷酸化，表明丝氨酸簇是必需的。这些数据表明，hGSK-3β可以磷酸化Shot的C端尾部。
Shot磷酸化是维持轴突微管组织所必需的
由于GSK-3β可以磷酸化Shot，我们询问Shot磷酸化是否对轴突微管组织重要。我们修改了shot位点，并生成了三个不同的果蝇品系，其中最后三个外显子被替换为一个融合的单一外显子，该外显子也编码C端GFP：i) 野生型，ii) 磷酸模拟型，iii) 磷酸缺陷型。通过实时RT-PCR确认了这些品系中shot的正常表达。
我们培养来自每个品系纯合胚胎的原代神经元，并对微管和GFP染色以增强Shot-GFP信号。在所有条件下，Shot-GFP低水平表达，并在轴突中呈点状分布。野生型Shot-GFP斑点经常与微管共定位，尽管Shot-GFP斑点的低强度妨碍了系统性的共定位量化。相比之下，磷酸模拟型Shot-GFP与微管几乎没有共定位。磷酸缺陷型Shot-GFP定位于微管，与野生型Shot-GFP相当。我们在与原代神经元群体共培养的果蝇成纤维样细胞中进行了补充实验，发现了可比的结果。野生型和磷酸缺陷型Shot-GFP与微管共定位，但磷酸模拟型则不然。这些结果支持Shot与微管结合的能力受GSK-3β介导的Shot磷酸化调节的假设。
我们接下来确定Shot的磷酸化状态是否影响微管成束。我们通过MDI测量微管解离，发现来自纯合野生型和磷酸模拟型shot胚胎的神经元未显示出实质性的微管解离。相比之下，来自磷酸缺陷型shot突变体的培养神经元显示出显著的微管解离。
尽管磷酸缺陷型Shot-GFP与磷酸模拟型Shot-GFP不同，能有效结合微管轴，但磷酸缺陷型突变导致微管解离。这表明Shot与微管轴的结合与微管解离无关。磷酸缺陷型Shot-GFP神经元中微管解束的一个解释可能来自Shot与Eb1的相互作用。如果Shot不能结合Eb1，它就失去了引导聚合微管进入平行束的能力。为了测试磷酸缺陷型Shot-GFP是否由于减少的Shot-Eb1相互作用而导致微管解束，我们对三个品系进行Eb1染色。我们发现磷酸模拟型Shot-GFP（而非磷酸缺陷型Shot-GFP）与Eb1共定位。这些结果支持磷酸缺陷型Shot-GFP不能有效结合Eb1的假设。
先前的工作发现，Shot-Eb1相互作用的丢失导致Eb1彗星尺寸增加，因为微管结合的Shot减缓了微管聚合。为了确定Shot的磷酸化状态是否影响Eb1与微管正端的结合，我们量化了每种条件下的彗星尺寸。表达磷酸模拟型Shot-GFP的神经元对彗星尺寸没有影响。相比之下，在磷酸缺陷型Shot-GFP存在下，Eb1彗星显著更大。总之，这些结果支持当Shot未被磷酸化时，Shot-Eb1相互作用丢失，导致Shot介导的微管引导丢失和微管解离的假设。
为了确定Shot和dGSK-3β是否在同一通路中起作用，我们使用我们的shot-GFP突变果蝇品系，并评估了在有或无GSK-3β抑制下的微管解束。如果效应是相加的，则它们独立起作用；如果不是，则它们共享机制。锂处理在野生型Shot神经元中增加解束三倍，但在磷酸缺陷型Shot中无影响，并且在磷酸模拟型Shot中未诱导解离。因此，GSK-3β抑制和Shot磷酸调节的丢失不是相加的，表明dGSK-3β通过Shot起作用。
dGSK-3β的激活和失活引起的运动行为缺陷与微管解束相关
我们最终询问微管解束是否影响神经元功能。为了测试这一点，我们测量了幼虫爬行速度作为一个简单的运动行为读数。表达过度活跃或失活dGSK-3β的三龄游走幼虫在60秒内爬行的距离显著缩短。
如上所示，由过度活跃dGSK-3β引起的解束通过共表达Eb1而非EGC-GFP得以挽救。类似地，仅当共表达Eb1-GFP时，爬行距离得以恢复。dGSK-3β的抑制通过Shot诱导微管卷曲。磷酸缺陷型（而非磷酸模拟型）Shot变体触发微管解束并降低爬行速度。
总之，这些结果表明，GSK-3β的失调损害神经元功能，其中微管解束直接导致运动缺陷。
讨论
GSK-3β在维持轴突微管束中的特定作用
我们描述了一个进化保守的机制模型，解释GSK-3β如何在神经元中维持平行微管束。我们发现，GSK-3β活性必须严格平衡以维持微管的平行束；GSK-3β的过度活化或失活导致果蝇和大鼠神经元中的微管卷曲。GSK-3β通过微管结合蛋白Tau和Shot调节微管成束，这两个微管调节因子通过Shot/Eb1介导的微管聚合引导来维持微管成束。Shot通过交联肌动蛋白和Eb1引导聚合微管进入平行束。当GSK-3β被抑制或过度活跃时，Shot介导的聚合微管引导以不同方式断裂。在这两种情况下，Shot介导的聚合微管引导减少，导致未成束的微管向质膜异常生长。GSK-3β过度活跃导致Tau从微管上丢失，要么通过脱离和/或蛋白质丰度减少，但不是通过总tau转录水平的变化。Tau的丢失导致Eb1与微管轴结合。Eb1被隔离到微管轴减少了可用于通过减少Shot/Eb1相互作用引导聚合微管形成适当束的Eb1。GSK-3β抑制通过减少Shot对Eb1的亲和力来减少Shot对微管的引导。
我们的数据支持一个模型，其中GSK-3β的磷酸化平衡Shot的两个关键功能——直接结合/稳定微管和通过结合Eb1引导微管聚合。吴等人发现，spectraplakin ACF7的微管结合受GSK-3β调节，其中ACF7在磷酸化后脱离微管。我们类似地观察到果蝇Shot与微管的关联在磷酸模拟型Shot中减少。此外，我们发现Shot与Eb1的相互作用取决于Shot的磷酸化状态，其中磷酸模拟型Shot尽管脱离微管仍能结合Eb1。这种转换可能是信号协调和控制Shot两个关键功能的机制：1) 当未磷酸化时稳定和保护微管；2) 引导聚合微管进入平行束。这让人想起为Clasp描述的类似机制，它包含两个GSK-3β基序。虽然吴等人未直接分析ACF7与Eb蛋白的相互作用，但他们观察到ACF7敲除细胞中微管生长的方向性在很大程度上是随机的。表达野生型ACF7（而非磷酸缺陷型ACF7）挽救了正确引导的微管生长。这表明GSK-3β在spectraplakin/Eb相互作用和微管聚合引导中的作用是进化保守的。目前尚不清楚磷酸化如何介导Shot的微管结合状态和Eb1结合状态之间的转换。我们使用ColabFold/AlphaFold2进行的结构计算机分析表明，关键的GSK-3β靶点簇位于Shot的两个Eb1二聚体结合SxIP位点和SxLP位点之间的连接区。增加该连接区的负电荷可能导致微管亲和力丢失，并通过与额外Eb1二聚体结合SxLP位点来加强与Eb1的相互作用。
神经元中微管组织的相关性
微管为轴突提供必要的结构支持，并且是所有长距离囊泡运输的底物。毫不奇怪，适当维持微管束是神经元发育和健康所必需的。微管束的缺陷可能触发轴突衰退。在培养条件下微管解束的情况导致微管卷曲和大脑中的轴突肿胀，这可能损害囊泡运输和动作电位传播，这是轴突病的关键特征。GSK-3β是轴突中平行微管结构的关键协调者。因此，轴突微管解束是受损的GSK-3β活性导致神经元衰退的可能机制。
在我们的系统中，GSK-3β调节影响神经元Tau和Eb1功能，我们想知道这是否具有生理后果。在果蝇中，改变的Tau活性/表达与几种表型变化相关：通过蘑菇体神经可塑性缺陷引起的习惯化行为和长期记忆变化、改变的乙醇敏感性、通过神经胶质细胞中脂滴形成失调改变的神经元氧化应激抵抗（例如在视网膜中），伴随改变的睡眠行为、减少的运动活动和降低的存活率等。类似地，Eb1功能障碍导致果蝇中的神经肌肉缺陷和机械感觉弦音器官缺陷。因此，我们研究了GSK-3β活性变化是否对幼虫爬行行为有功能影响。确实，dGSK-3β/sgg活性的失调影响幼虫爬行。我们表明，在原代神经元中恢复微管成束的干预措施也改善了幼虫爬行，表明在培养中观察到的微管解束表型在体内具有明确的功能相关性。
广泛的前期工作支持GSK-3β/Shaggy在神经元发育和维持中的核心作用。缺乏shaggy的胚胎显示出严重的发育缺陷。在分化的神经元中，dGSK-3β/sgg调节轴突货物运输并限制突触生长，调节的丢失导致结构和功能突触异常。我们最近表明，过度活跃或失活的dGSK-3β导致视觉缺陷，这可能与果蝇视网膜中Tau功能障碍描述的表型有关。总之，这些发现强调了GSK-3β在神经元功能中的广泛重要性。未来的工作应探索GSK-3β的哪些特定作用和底物是不同神经元背景下观察到的多样化表型的基础。
我们的发现对于GSK-3β过度活跃并导致Tau过度磷酸化和神经原纤维缠结形成的神经退行性疾病（如阿尔茨海默病和帕金森病）非常重要。很多重点放在了这些聚集体上。在果蝇和小鼠模型中的工作表明，仅Tau丢失不会引起严重的表型，除了轻微的行为和运动缺陷。然而，我们认为内源性Tau功能的丢失可能具有另一个重要影响。GSK-3β过度活跃使Shot和Tau都从微管上脱离，破坏了它们冗余的稳定作用。先前已经表明，这种联合丢失会导致严重的微管不稳定、运输受损和突触缺陷。我们提出这是过度活跃的GSK-3β在神经退行性疾病中驱动神经元衰退的机制。
由GSK-3β失调引起的微管组织丢失可能不仅在神经退行性疾病中相关，而且在衰老中也相关，许多神经元轴突在此过程中丢失。最近的一项研究发现，Tau、Shot和EB1对于维持衰老轴突中的微管至关重要。衰老神经元中这些蛋白质的丢失导致微管束衰退，随后引起轴突和突触终末的衰退。值得注意的是，GSK-3β表达随着年龄增长而增加。因此，GSK-3β活性的失调可能是随着年龄增长微管调节因子丢失以及微管完整性的潜在原因。
GSK-3β是各种神经系统疾病（从阿尔茨海默病、帕金森病和亨廷顿病到神经发育和情绪障碍）的一个非常有前景的治疗靶点。然而，涉及全球性GSK-3β抑制剂的试验大多失败。我们提出了一个模型，解释为何全球性抑制GSK-3β尚未成功。正常发育依赖于精细调节的、时空调节的GSK-3β，这仍然知之甚少。偏离GSK-3β的最佳水平甚至轻微都会导致神经元发育、功能和形态问题。
材料与方法
（略）
