一种含有珍珠粉的多功能支架，用于骨骼再生：同时促进骨形成、免疫调节和血管生成

《Biomaterials》：A Multifunctional Pearl Powder-Incorporated Scaffold for Bone Regeneration: Simultaneous Enhancement of Osteogenesis, Immune Modulation, and Angiogenesis

骨再生仿生复合材料支架的协同免疫调节与血管生成耦合机制研究。通过梯度冷却冰模板技术制备GelMA/PP/DMOG复合支架，实现多级孔道结构（孔径>90μm）与高孔隙率（62.2%-81.5%），促进成骨细胞分化及血管内皮迁移。支架通过抑制NF-κB/MAPK信号通路调控巨噬细胞向M2型极化，同时激活HIF-1α/VEGF通路增强血管生成，在兔 femoral condyle 缺损模型中实现骨再生加速、免疫微环境优化和血管网络重构的三重协同效应。

　　

魏赫|金旭|赵建明|王志超|孔瑞瑞|赵飞龙|李艳|孟浩业|郑玉东

北京科技大学材料科学与工程学院，北京100083，中国

摘要

骨骼缺陷的再生需要精确调控炎症反应、血管形成和骨形成过程的时空顺序。一个尚未解决的主要问题是制造能够协同结合免疫调节与促血管生成-成骨作用的生物材料支架，以层次化地调控这一再生级联反应。本研究开发了一种新型仿生复合支架，通过将明胶甲基丙烯酸酯（GelMA）与珍珠粉（PP）和二甲氧基丙氨酸（DMOG）结合，在结构和成分上复制了天然骨骼，从而增强骨骼修复能力。该支架通过可控梯度冷却、冰模板技术和紫外光交联技术制备而成，具有明显的大孔结构，平均孔径大于90微米。该支架表现出优异的物理化学性能，包括高孔隙率（62.2%-81.5%）、良好的膨胀特性（476.4%-737.4%）、出色的机械性能以及长期的结构稳定性（在PBS溶液中浸泡180天后）。体外评估显示，该支架具有优异的细胞粘附能力，并显著增强了干细胞的成骨分化能力，这归因于PP和DMOG的协同作用。值得注意的是，该支架有效调节了巨噬细胞的极化，通过抑制肿瘤坏死因子（TNF）、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）和活化B细胞的核因子κ轻链增强子（NF-κB）信号通路，使脂多糖（LPS）激活的巨噬细胞向促再生M2表型转变。此外，它还显著促进了内皮细胞的迁移和管状形成试验中的毛细血管网络形成。在大鼠股骨髁缺损模型中，该支架展示了三重治疗效果：加速骨骼再生、显著的免疫调节作用和增强的血管生成。这些多功能特性使得这种工程支架成为临床可行的骨骼组织再生解决方案。

引言

骨骼组织具有显著的自我修复能力。通过持续的重塑过程，骨骼保持了其结构完整性和生理功能[1]。在轻微损伤的情况下，骨骼可以完全再生，而不会形成纤维化疤痕，完全恢复其原始结构和机械性能。然而，在处理由感染和内分泌疾病引起的较大缺损或病理状况时，这种再生能力就变得不足[2]，[3]。全球人口结构的变化，包括人口老龄化、肥胖率的上升以及人们对医疗保健意识的提高，显著增加了对骨移植的需求。目前，骨移植是全球第二常见的组织替代手术，仅低于输血[4]。这一临床挑战推动了骨组织工程的发展，为修复大面积骨缺损提供了创新解决方案。

从仿生的角度来看，与天然骨骼在成分上更为相似的支架在植入后表现出更强的骨整合能力和更低的免疫反应[5]。骨骼组织是一种天然存在的纳米复合材料，具有低密度、出色的机械强度、大孔结构和高孔隙率，其主要成分是羟基磷灰石（HA）和胶原蛋白[6]，[7]。甲基丙烯酸酐改性的明胶（GelMA）作为一种水解胶原蛋白衍生物，由于其抗原性显著降低（由于破坏了天然的三螺旋结构）、成本效益高和商业可用性，成为胶原蛋白的更可行替代品[8]。这些优势使GelMA成为一种多功能生物材料，应用于从基本细胞培养基到复杂的组织工程构造以及治疗剂（药物、基因或生长因子）的先进递送系统[8]，[9]，[10]。此外，最近的研究关注了基于碳酸钙的天然材料，特别是珍珠粉（PP），作为骨修复应用的有希望的替代品。PP的主要无机成分是碳酸钙（CaCO₃）[11]，与HA相比，其降解速率更为有利。尽管有机基质仅占PP组成的5%，但它含有许多生物活性因子，显著增强了细胞增殖、分化和成骨潜力[11]。PP的治疗价值还因其丰富的微量元素而得到进一步提升，这些微量元素具有显著的抗氧化、抗炎、抗衰老和促进伤口愈合的作用[11]，[12]，[13]。通过熔融沉积建模三维（3D）打印技术，郭等人[14]制备了一种多孔的PLA/PP复合支架。得益于PP中含有的生物有机基质，该复合支架比纯PLA支架更能促进大鼠骨髓来源的间充质干细胞（rBMSCs）的增殖和成骨分化。李等人[15]通过冷冻干燥方法制备了一种含有珍珠/磷酸钙（p/CaP）粉末的壳聚糖（CS）支架。引入p/CaP提高了CS支架的压缩强度和模量，并增加了MG-63细胞的粘附和增殖。杜等人[16]采用3D打印技术制备了珍珠/CaSO₄复合支架，随后进行了水合处理。与CaSO₄支架相比，该复合支架促进了rBMSCs的增殖和成骨分化，并刺激了兔股骨髁缺损处的新骨形成。这些综合发现强调了PP作为多功能骨再生材料的巨大潜力。虽然PP在骨再生中的成骨特性已被广泛研究，但其潜在的免疫调节和促血管生成效应在当前研究中仍待探索。

二甲氧基丙氨酸（DMOG）是一种典型的缺氧模拟剂，能够在常氧条件下有效诱导缺氧反应[17]，[18]。DMOG可以通过激活缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）表达和上调PI3K/Akt信号通路来增强干细胞的促血管生成能力。这些分子事件对于血管内皮生长因子（VEGF）的上调至关重要，进而介导血管生成和血管化与成骨之间的关键耦合[17]。张等人[19]成功将DMOG掺入沸石咪唑olate框架-8纳米颗粒中，显示出在体外和体内更好的血管生成和成骨效果，最终实现了功能性血管化骨的形成。除了成骨应用外，DMOG还表现出显著的抗炎特性。多项研究证实了其对各种炎症状况的保护作用[20]，[21]，[22]。陈等人[23]提供了令人信服的证据，证明DMOG通过下调促炎介质（单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）、白细胞介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和分化簇86（CD86）以及抑制活化B细胞的核因子κ轻链增强子（NF-κB）通路激活，抑制了M1型巨噬细胞的极化。在小鼠牙周炎模型中，DMOG治疗有效减少了牙槽骨丢失，调节了巨噬细胞的极化（降低了M1/M2比例），并使细胞因子谱向抗炎状态平衡[23]。

基于以上研究，开发一种结合PP和DMOG的成骨、促血管生成和免疫调节特性的新型支架，对于提高骨骼再生效果具有重大潜力。人们推测，在GelMA支架中结合PP和DMOG会产生比单一成分支架（例如仅含PP或仅含DMOG的支架）更强的成骨、促血管生成和免疫调节效果。为了保持支架内生物活性添加剂的生物活性，我们利用了GelMA的光交联特性。首先通过可控梯度冷却和冰模板技术制备了适合细胞增殖和迁移的层次化多孔结构。在冰晶完全形成后，立即在紫外（UV）照射下进行光交联，随后进行冻干处理以确保长期储存稳定性。关键的是，结晶后的交联方法能够精确控制支架结构，获得所需的大孔形态和高孔隙率组合。GelMA的固有生物材料特性与PP结合后，产生了一种具有最佳生物相容性和支持干细胞粘附性的混合支架。从支架中释放出的DMOG和PP可以增强成骨作用，诱导免疫调节并促进血管生成，从而加速骨骼修复（图1）。凭借优异的物理化学性能和生物功能性，GelMA/DMOG/PP复合支架成为临床可行的骨再生选择。

节选内容

GelMA的合成

GelMA是根据已发表的协议[24]合成的。首先，用去离子水溶解Na₂CO₃和NaHCO₃制备0.25 M的碳酸盐缓冲液，并使用2 M NaOH和HCl溶液调整pH至9.0。然后，将10克明胶（Gel，Aladdin，中国）溶解在100毫升制备的缓冲液中，接着加入1毫升甲基丙烯酸酐（MAA，Sigma，美国）。将反应混合物加热至50°C并持续搅拌3小时。

GelMA/DMOG/PP支架的¹H-NMR、FTIR和XRD光谱、热稳定性、孔隙率、膨胀率和药物释放

NMR分析显示Gel和GelMA之间存在明显的光谱差异（图S1）。具体来说，GelMA在5.4和5.6 ppm处出现了两个特征性新峰（峰a+b），对应于甲基丙烯酰基[24]，而2.9 ppm处的峰（峰c）（归因于游离氨基）[24]显著减弱。这些光谱变化表明大约95%的明胶中的游离氨基被甲基丙烯酰胺基取代，这一点通过接枝反应得到了验证。

结论

在本研究中，通过可控梯度冷却和冰模板技术制备了负载有PP和DMOG的GelMA混合水凝胶支架，随后在紫外光照射下进行光交联并冻干。FTIR分析确认了支架中存在PP和DMOG。XRD结果表明，PP组分主要包含文石结构，同时存在少量方解石相。DMOG的释放曲线显示GelMA/DMOG/PP支架

CRediT作者贡献声明

赵飞龙：验证、研究。 孔瑞瑞：验证、研究。 孟浩业：软件、资源、方法学、研究、数据管理。 李艳：资源。 郑玉东：撰写 – 审稿与编辑、监督、资源获取、资金筹集。 魏赫：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、监督、资源获取、方法学、研究、资金筹集、数据管理、概念构思。 金旭：撰写 – 审稿与编辑、资源、方法学。

数据可用性

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利益冲突声明

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致谢

本工作得到了江苏省自然科学基金基础研究项目（基本研究计划）[项目编号BK20240493]；北京市自然科学基金[项目编号L222035、L244003]；国家自然科学基金[项目编号52273119]；北京科技大学青年教师跨学科研究项目（中央高校基础研究基金）[项目编号FRF-IDRY-23-019]；以及南京康达学院的人才项目的财政支持。