《Biomaterials Advances》：Development of a HER1/CP2c dual-targeting biopharmaceutical for HER1-overexpressing head and neck cancer
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双靶向抗肿瘤疗法DTAT通过结合HER1单链抗体和细胞穿透性毒素CPTin，有效抑制头颈部鳞状细胞癌并减少传统疗法副作用。
Kyu Tae Byun|Junmin Cho|Boram Kim|Inbeom Lee|Eun Byeol Kim|Dongsun Park|Sang-Woo Han|Hyung-Sik Won|So Yeong Cheon|Chan Gil Kim
韩国忠清大学生物医学与健康科学学院生物技术系及生物医学与健康科学研究所（RIBHS），忠州市，27478，韩国
摘要
随着药物的发展，癌症导致的死亡率持续下降。然而，主要癌症的发病率仍然很高。头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）是非皮肤癌中第六大常见类型，该癌症主要表达人表皮生长因子受体1（HER1）。为了选择性消除HNSCC，开发了针对HER1的单克隆抗体（mAb）治疗药物西妥昔单抗（Cetuximab）。尽管获得了美国食品药品监督管理局（US-FDA）的批准，但使用西妥昔单抗或其他抗癌药物仍会出现一些并发症，如黏膜炎症、皮疹、颅内感染和神经功能缺陷。为了解决这些问题，我们开发了一种类似抗体药物偶联物（ADCs）的抗癌平台，称为双靶向抗癌疗法（DTAT），该平台由用于结合特定抗原的mAb或单链片段变量（scFv）定位位点以及能够穿透细胞并与癌蛋白CP2c结合的细胞毒性载荷组成，CP2c通过可切割连接序列（CLS）与载体连接，该连接序列可被基质金属蛋白酶-11（MMP-11）切割。基于这一DTAT平台，我们生成了DTAT-D351，它同时靶向HER1和CP2c，作为HNSCC的抗癌生物制剂。我们的数据显示，DTAT-D351具有高生产率和对HER1的强结合亲和力，并且对过度表达HER1的癌细胞和A431表皮样鳞状癌细胞表现出高抗癌活性。此外，它在免疫细胞和正常细胞中未引起不良反应。总之，DTAT-D351（在此称为Cetuximab scFv-CPTin）是一种有前景且有效的抗癌剂，适用于治疗过度表达HER1的癌细胞，包括头颈部癌症。
引言
癌症是一个全球性的健康问题，与高死亡率相关[1]。尽管癌症死亡率逐渐下降，但乳腺癌、胰腺癌、结直肠癌和宫颈癌等主要癌症的发病率却在上升[1]。当前的抗癌治疗方法，如化疗、手术和放疗，随着科学技术的进步而不断发展[2]。例如，外科手术借助机器人技术和荧光引导可视化技术得到了改进；放疗利用了先进的成像系统和强度调节系统；化疗则通过开发植物药物得到了进步[2]。然而，许多问题仍然存在，如肿瘤切除不完全、药物耐药性和不良反应[2]。这些限制促使了新型抗癌药物疗法的发展[2][3]。最近，各种生物技术方法，如嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）和抗体药物偶联物（ADCs），被开发为靶向癌症疗法[4]。为了有效靶向和消灭癌细胞，已经确定了一些癌细胞特异性表达的蛋白质作为生物标志物，并用于抗癌药物疗法[4]。在癌症特异性分子中，人表皮生长因子受体1/表皮生长因子受体（HER1/EGFR）主要在肺、皮肤、肠道和大脑的上皮细胞中表达[5]。HER1参与正常细胞的增殖、分化和存活，反映了其在组织稳态中的重要性[5]。然而，HER1的激活在肿瘤细胞的增殖、迁移、黏附、转移和血管生成中起重要作用，被认为是致癌因素[5][6]。HER1在头颈部癌、皮肤癌和肺癌等上皮恶性肿瘤中过度表达[6][7][8]，特别是超过90%的头颈部肿瘤都表现出HER1的过度表达[6]。此外，HER1的过度表达与疾病恶化、临床预后不良以及对化疗的耐药性相关[9]。因此，设计了一种单克隆抗体（mAb）西妥昔单抗（Cetuximab），旨在靶向HER1的细胞外域并抑制其活性[9]。随后，美国食品药品监督管理局批准西妥昔单抗与化疗联合使用，用于治疗晚期头颈部癌症的局部复发或转移性鳞状细胞癌[9][10]。然而，单独使用西妥昔单抗或联合治疗都可能导致严重的不良反应，如黏膜炎症、皮疹以及血液和淋巴系统异常[10]。
为了改进西妥昔单抗的效果，我们采用了类似ADC的概念。简单来说，ADCs是一种生物工程制剂，包含针对肿瘤特异性抗原（TSAs）或肿瘤相关抗原（TAAs）的mAb、可化学切割或不可切割的连接序列以及细胞毒性载荷[11][12]。mAb作为载体，将细胞毒性剂选择性地递送到表达目标分子的癌细胞[11][12]。当细胞毒性载荷到达特定癌细胞时，连接序列会被癌细胞表达的蛋白酶切割[13]。从ADCs上释放出的细胞毒性载荷会引发治疗作用并杀死癌细胞[11]。许多关于ADCs的先前研究表明，它们在治疗效果上有所提升[14]。ADCs具有优势（例如，低脱靶毒性、高靶标毒性、精确靶向性和高耐受性）[14]。因此，一些ADCs，如布伦妥昔单抗维多汀（Brentuximab vedotin）和曲妥珠单抗艾美坦辛（Trastuzumab emtansine），已经获得了FDA的批准[14]。然而，ADCs也被报道会引起不良反应，如淋巴细胞减少、周围神经病变、诱导性毒性、肝毒性和出血[14][15]。在布伦妥昔单抗维多汀的情况下，抗CD30 mAb通过蛋白酶可切割连接序列与抗有丝分裂药物MMAE结合，该药物通过内吞作用进入CD30表达细胞，并从内体释放到细胞核中，导致细胞周期停滞和细胞凋亡[16]。尽管概念理想，但布伦妥昔单抗维多汀在临床研究中仍出现多种不良反应，包括周围感觉神经病变、运动神经病变和中性粒细胞减少，这些不良反应与单甲基奥利司他汀E（MMAE）的副作用有很大重叠[17][18]。作为毒性载荷，传统的化疗药物（如多柔比星和甲氨蝶呤）、微管抑制剂（如MMAE和单甲基奥利司他汀F（MMAF）以及DNA损伤药物（如拓扑异构酶I抑制剂和烯丙啶）已被使用；然而，它们显示出临床不良反应，包括毒性不足、药物耐药性和选择性差[19]。细胞毒性载荷在CLS切割后必须有效地内吞进入目标细胞以诱导肿瘤细胞死亡[20][21]。然而，大多数ADC相关的毒性主要归因于早期连接序列切割和药物释放失控[18]。其他因素也需要优化，以发挥其特定作用[22]。目标抗原需要在肿瘤细胞中高度表达，在健康正常细胞中表达较少或不表达[20]。嵌合或人源化mAb有助于逃避免疫反应，mAb对目标抗原的高亲和力和亲和力对于细胞毒性载荷在指定位置发挥作用至关重要[20][22]。连接序列需要在循环过程中保持稳定，不被切割或降解，并能被癌细胞表达的酶反应准确切割[21]。因此，目前正在开发高效ADC载荷[19]。
最近的研究表明，CP2c是一种新的癌症治疗靶点[23]。CP2c是CP2家族的转录因子（TF），通过形成CP2c同源四聚体或CP2c/CP2b/PIAS1异源六聚体复合物来调节转录[24]。在癌症中，肿瘤的恶性程度与CP2c的表达水平相关，CP2c的过度表达在肿瘤侵袭、转移和致癌依赖性中起关键作用[23]。基于先前的研究，我们选择并验证了一种能够穿透细胞的CP2c靶向肽（以下简称CPTin），该肽包含一个针对CP2c寡聚化结构域的序列（COT，NYPQRP）和一个能够穿透细胞的肽（CPP，iRGD序列：CRGDKGPDC），后者在细胞内递送后与CP2c结合并解离复合物，从而导致癌细胞死亡[23][25]。如前所述，可切割连接序列对于细胞毒性载荷的功能至关重要，必须在目标细胞处精确切割[26]。在这项研究中，我们设计了一个可切割连接序列（CLS），使其能够被金属肽酶-11（MMP-11）识别和切割。通过结合CPTin和CLS，我们构建了一个类似ADC的单蛋白平台，称为双靶向抗癌疗法（DTAT）。基于DTAT平台，引入了针对HER1的西妥昔单抗单链片段变量（scFv）作为载体，从而生成了类似ADC的抗癌肽DTAT-D351。
与传统依赖细胞毒性载荷的ADC方法不同，本研究引入了一种重组蛋白，其中包含一种能够促进癌细胞死亡的肿瘤靶向肽。因此，基于我们的概念，本研究旨在探讨DTAT-D351（称为Cetuximab scFv-CPTin）是否具有作为头颈部癌症和过度表达HER1的癌细胞抗癌疗法的潜力，并将其与商业药物进行了比较，包括顺铂（一种用于肺癌、头颈部癌症和淋巴瘤的金属基抗癌疗法）[27]、喹诺酮类抑制剂1（FQI1，一种针对致癌转录因子LSF的微管靶向药物）[28]、吉西他滨（一种干扰DNA合成的化疗药物）[29]、紫杉醇（一种与白蛋白结合的微管抑制剂）[30]、MMAE（一种干扰微管的抗有丝分裂剂，用作ADC中的载荷）[31][32]、替莫唑胺（一种常与放疗联合使用的DNA烷化剂，用于脑癌）[33]、卡莫司汀（一种用于脑肿瘤的DNA烷化剂）[34]和拉帕替尼（一种针对HER1和HER2细胞内酪氨酸激酶结构的化学抑制剂）[35][36]。我们的发现验证了Cetuximab scFv-CPTin的显著抗癌潜力。与现有的商业治疗药物相比，Cetuximab scFv-CPTin改进的抗癌活性突显了其作为未来药物应用的潜力。这种癌症相关分子靶向和肽载荷设计的整合可以发展为针对癌症患者的个性化治疗方案。
材料
用于材料表达的pcDNA?3.4 TOPO?质粒载体从Addgene购买（#A14308，RRID: Addgene_226841，美国加利福尼亚州卡尔斯巴德）。为了构建重组DNA，使用了从Bioneer（韩国大田）购买的化学合成寡核苷酸，通过PCR扩增后插入pcDNA?3.4 TOPO?质粒载体中。使用ExpiFectamine? CHO Transfection Kit（Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）进行了DTAT-D351的转染。
DTAT-D351的设计、表达、纯化和体外抗癌活性
为了生产HER1 scFv和DTAT-D351，分别将HER1 scFv或DTAT-D351的基因序列插入哺乳动物表达质粒pcDNA3.4? TOPO?载体中（图1A）。这些重组基因序列被放置在I和I酶切割位点之间。CHO-S细胞被转染了编码重组蛋白的质粒，从培养基中获得了纯化的蛋白质。通过...
讨论
当前的生物工程技术为药物开发提供了基础[37]。在癌症治疗领域，为了克服传统疗法的局限性，不断引入了靶向治疗、免疫治疗、基因治疗和具有增强疗效和安全性的改良疗法[2][37][38]。其中，我们设计并建立了一个类似ADC的DTAT平台，用于生产治疗肽，以解决传统药物的问题并克服...
CRediT作者贡献声明
Kyu Tae Byun：撰写——原始草稿、可视化、方法学、研究、数据分析、数据管理。Junmin Cho：撰写——原始草稿、可视化、方法学、研究、数据分析、数据管理。Boram Kim：方法学、研究。Inbeom Lee：方法学、研究。Eun Byeol Kim：方法学、研究。Dongsun Park：撰写——审阅与编辑。Sang-Woo Han：撰写——审阅与编辑。Hyung-Sik Won：撰写——审阅与编辑、资金获取。
资助和专利
本研究得到了韩国国家研究基金会（NRF）基础科学研究计划的支持，该计划由教育部资助（编号：NRF-2020R1I1A3071938）。本研究受到韩国专利（编号：KR 10-2023-0166820）的保护。本研究还得到了区域创新系统与教育（RISE）计划的支持，该计划由教育部和忠清北道政府资助。
