《Biomaterials Advances》：Engineering bacterial outer membrane vesicles synergetically boost superactivated anti-tumor immunity induced by radiotherapy
via sustained DNA damage
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抗肿瘤免疫治疗联合放疗通过新型“粒子胶囊”纳米系统实现协同增效，利用Fe3O4纳米颗粒催化产羟基自由基放大DNA损伤，同时抑制ATR修复通路，并借助工程化外膜小泡（OMVs）穿透肿瘤组织及血脑屏障，激活固有免疫信号通路，最终显著抑制肿瘤生长并增强抗肿瘤免疫应答。
顾光宇|刘晓|顾洪昌|卢一军|刘饶|丁琦|赖欣|王新毅|吴正炎|袁平|建友|双湖源|钱俊超
中国科学技术大学第一附属医院放射肿瘤科，生命科学与医学系，安徽省合肥市，230031，中华人民共和国
摘要
放疗引起的核DNA损伤所诱导的抗肿瘤免疫反应正成为一种有前景的策略，其中cGAS在微核中的积累会触发细胞内的炎症途径。然而，放疗诱导的DNA损伤也会激活DNA损伤反应（DDR），从而抑制抗肿瘤炎症。为了解决这个问题，我们开发了一种创新的“颗粒胶囊”纳米系统，该系统能够放大DNA损伤同时抑制DDR。磁铁矿纳米颗粒（Fe?O? NP）通过ABC转运通道被细菌“吞噬”，然后与ATR抑制剂VE822一起包装在经过iRGD肿瘤导向肽工程改造的细菌外膜囊泡（OMV）中。这种设计使得纳米系统能够有效穿透肿瘤组织和血脑屏障，促进深入肿瘤的递送。该系统利用Fe?O?驱动的Fenton反应产生更多的羟基自由基（•OH），并抑制ATR以阻断DNA修复，从而持续造成DNA损伤并抑制DDR。此外，OMV本身具有免疫刺激作用，能够协同增强抗肿瘤免疫。因此，这种策略降低了肿瘤的放射抵抗性，重新激活了由DNA损伤引起的炎症，促进了效应T细胞的浸润，并克服了肿瘤血管不规则和淋巴引流不良带来的挑战，最终在小鼠体内实现了显著的肿瘤生长抑制和更强的抗肿瘤免疫反应。
引言
放疗（RT）直接或通过产生的细胞内活性氧（ROS）间接引起的DNA损伤会导致有丝分裂过程中微核的形成[1]，[2]。微核中环状GMP-AMP合成酶（cGAS）的积累能够识别核DNA损伤信号，从而激活炎症途径并通过免疫细胞募集重塑肿瘤微环境[3]，[4]。这些免疫介导的机制对于局部和全身性的肿瘤反应都至关重要，例如远隔效应[5]，[6]。因此，利用DNA损伤来促进肿瘤内的局部炎症反应是一种有前景的抗肿瘤治疗策略，尤其是在与放疗联合使用时。
然而，单独的放射诱导的DNA损伤可能不足以引发强烈的免疫炎症反应，因为它们通常会激活DNA损伤反应（DDR）途径[7]，[8]。这会导致细胞周期停滞和DNA修复，从而减弱促炎信号[9]，[10]。为了解决这一限制，引入了共济失调毛细血管扩张症和Rad3相关（ATR）抑制剂来破坏放射诱导的细胞周期停滞和DNA修复[11]，[12]。肿瘤细胞经常存在缺陷的G1检查点，在照射后特别依赖于S和G2/M检查点进行DNA修复[13]。ATR激酶磷酸化并激活检查点蛋白，强制细胞停留在G2期，并阻止未修复DNA的细胞进入有丝分裂，从而抑制细胞凋亡[14]。因此，抑制ATR活性可以减轻细胞周期停滞，阻碍DNA修复过程，并维持DNA断裂，恢复放射诱导的炎症和细胞凋亡。
除了激活DDR之外，放疗抵抗性还受到体内耐受的辐射剂量有限以及细胞内ROS清除的限制，这两者共同限制了DNA损伤和细胞死亡的程度[9]，[15]。为了增强肿瘤内的氧化应激，已经广泛研究了纳米颗粒，特别是Fe?O?纳米颗粒（NP），因为它们易于合成、生物相容性好，并且能够在原位将过氧化氢（H?O?）转化为高细胞毒性的羟基自由基（•OH）[9]。虽然放疗可以产生大量的ROS，包括超氧阴离子（O??），但这些ROS通常会被超氧化物歧化酶解毒，导致H?O?的形成，反而有助于放射抵抗[16]。通过引入基于铁的纳米材料，H?O?可以进一步转化为•OH，后者比O??具有更强的氧化潜力，能够造成广泛的DNA损伤，从而提高肿瘤细胞对放疗的敏感性[17]。
尽管取得了这些进展，纳米颗粒和小分子抑制剂的治疗效果往往受到肿瘤穿透性差、细胞摄取量低以及肿瘤内间质压力升高的限制[17]。细菌外膜囊泡（OMV）是由革兰氏阴性细菌自然分泌的，由于其强大的组织穿透能力、能够穿越生物屏障以及易于工程改造的特点，最近成为药物递送的有希望的候选者[16]，[18]。重要的是，OMV具有来自病原体相关分子模式（PAMPs）的天然免疫刺激作用，这些作用可以激活先天免疫途径，如Toll样受体（TLR）信号通路和cGAS-STING通路，促进树突状细胞成熟、细胞因子释放和I型干扰素反应[19]，[20]，[21]。这些途径增强了抗肿瘤免疫，并与DNA损伤引起的炎症信号协同作用[20]。此外，用肿瘤导向肽（如iRGD）进行功能化可以增强OMV在密集肿瘤组织和血脑屏障中的穿透能力，使其适用于中枢神经系统肿瘤[16]。
然而，OMV作为纳米载体的临床应用面临挑战：由细菌外膜出芽产生的囊泡通常直径在几十到几百纳米之间，其固有的封装能力不足以有效装载无机纳米颗粒[21]。为了高效地将Fe?O? NP装载到OMV中，我们对纳米颗粒进行了葡萄糖聚合物（GP）的表面修饰，这使得大肠杆菌BL21（DE3）能够通过ABC转运通道主动摄取它们[22]。在肽聚糖降解引起的细菌裂解后，释放出含有Fe?O? NP的OMV（iOF），随后装载ATR抑制剂VE822（iOFV）[23]。这种“颗粒胶囊”纳米系统利用了Fe?O? NP的Fenton催化活性和ATR抑制的DNA修复阻断作用，从而在放疗下增强•OH的产生，诱导严重的、持续的DNA损伤，并抑制DDR信号[24]。因此，这种策略不仅降低了肿瘤的放射抵抗性并重新激活了由DNA损伤引起的炎症途径，还与OMV的天然免疫原性协同作用，增强了抗肿瘤免疫[25]。此外，iRGD修饰使得OMV能够有效穿透肿瘤组织和血脑屏障，有助于治疗其他难以治疗的恶性肿瘤[26]（图1）。
重要的是，除了放大DNA损伤外，iOFV还能确保活性剂在肿瘤内的长时间保留，从而实现持续的DNA断裂、细胞因子释放和免疫细胞浸润的时间协调。这种持续的DNA损伤作为一个持续的免疫原信号，增强了放射诱导的炎症途径。同时，OMV通过PAMP介导的TLR和cGAS-STING信号通路天然激活先天免疫途径，进一步促进树突状细胞成熟、细胞因子分泌和I型干扰素的产生。因此，iOFV结合了两种机制——持续的DNA损伤驱动的免疫原性和OMV衍生的免疫刺激，产生了强大而持久的抗肿瘤免疫反应。
总体而言，这项工作建立了一个可扩展的多功能平台，该平台能够放大DNA损伤，抑制DDR，并利用OMV作为药物载体和免疫刺激剂的双重作用，为推进放疗诱导的免疫疗法提供了有力策略。
材料与试剂
六水合三氯化铁（FeCl?·6H?O，≥99%）、四水合硫酸亚铁（FeSO?·4H?O，≥99%）、醋酸（≥99.5%）、氢氧化钠（≥96%）、氢氧化铵溶液（NH?OH，25%）、3-氨基丙基三乙氧基硅烷（APTES）、葡萄糖聚合物（GP；poly [4-O-(α-D-葡吡喃糖)-D-葡吡喃糖]，Sigma-Aldrich）、氯乙酸和丙酮均购自上海化学试剂有限公司（中国上海）。所有化学品和溶剂均为分析级，按收到时的状态使用。RPMI-1640
iOFV的制备与表征
如图1A所示，我们首先设计并制备了基因改造的细菌外膜囊泡。广泛用于表达重组蛋白的大肠杆菌BL21（DE3）菌株具有低脂多糖（LPS）产生的特性[27]，[28]，[29]。我们测试了从BL21（DE3）中提取的外膜囊泡的细胞毒性（图1B）。外膜囊泡的低细胞毒性支持选择BL21（DE3）作为重组蛋白的宿主细胞
结论
放疗诱导的抗肿瘤免疫反应是一种新兴且有前景的策略，主要由核DNA损伤触发。这种损伤激活了细胞内的炎症途径，特别是通过cGAS在微核中的积累。然而，这种免疫反应的效果往往受到肿瘤DDR途径的限制，DDR通常会修复放射诱导的DNA损伤并抑制抗肿瘤炎症的激活。在这项研究中，我们开发了一种新型的“颗粒胶囊”
CRediT作者贡献声明
顾光宇：撰写——原始草稿、可视化、方法学、研究、数据分析、概念化。刘晓：撰写——审阅与编辑、验证、方法学、研究、数据分析。顾洪昌：资源提供、研究、数据管理。卢一军：资源提供、研究。刘饶：可视化、软件操作、数据管理。丁琦：验证、研究。赖欣：资源提供、研究。王新毅：研究、数据管理。吴正炎：
伦理批准与参与同意
动物实验获得了中国科学院合肥物理科学研究所动物护理与使用委员会的批准。伦理批准编号为DWLL(E)-2024-09。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文报告的工作。
致谢
本研究得到了国家自然科学基金（资助编号U1932158、81871085、82271519）、山东省自然科学基金（资助编号ZR2019LZL018）、安徽省杰出青年科学家基金（资助编号2208085J10）、中国科学院合肥科学中心协同创新计划（资助编号2019HSC-CIP003）、中国博士后科学基金（资助编号2019M652403）以及博士后项目的支持
