《Biomaterials》：Recapitulating Apicobasal Tissue Polarity in Extracellular Matrix-incorporated Airway Organoids
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本文针对现有气道类器官模型在重现上皮-细胞外基质相互作用与顶向外极性方面的局限性，提出并验证了一种融合人肺脱细胞基质微粒的顶向外气道类器官（dECM-AoAO）系统。该系统不仅模拟了气道组织的生理结构，促进了更接近真实的谱系分化，还响应了IL-13的病理刺激，并建立了基于纤毛驱动的类器官运动的无标记功能评估方法，为研究气道稳态与疾病提供了一个更具生理相关性的平台。
气道是人体呼吸的门户，其内衬的上皮细胞构成了抵御外界病原和污染物的第一道防线。这道防线不仅依赖于分泌黏液的杯状细胞和具有纤毛的多纤毛细胞的协同工作，也离不开基底层的干细胞进行持续的更新与修复。这种复杂的功能与结构，建立在一种被称为“顶-基底极性”的精密空间组织之上：细胞顶面朝向气道腔，直接面对外部环境；基底面则紧密地附着在由胶原、层粘连蛋白等构成的细胞外基质上，不仅获得物理支撑，也接收着决定其存活、分化和功能的生物化学信号。
因此，要深入理解气道在健康和疾病状态下的行为，尤其是在慢性阻塞性肺病、哮喘等疾病中上皮-基质相互作用如何失调，就需要能够忠实模拟这种空间结构和相互作用的实验室模型。传统的类器官技术面临着一个两难选择：将上皮细胞包裹在水凝胶（如Matrigel）中培养，可以形成细胞外基质环境，促进细胞间相互作用，但得到的往往是“顶向内”的类器官，其关键的功能性顶面被封闭在内部，难以直接接触和施加外部刺激，如病原体或药物。反之，如果去除外部基质培养，虽然可以得到“顶向外”的类器官，使其纤毛暴露在外，便于研究，但又会牺牲掉关键的基质信号，导致模型内的细胞类型过于单一（几乎全变成多纤毛细胞），缺乏分泌细胞和基底干细胞等重要组分，因而无法模拟复杂的生理和病理反应。
卡耐基梅隆大学的Gong, Zhuowei等人发表在《Biomaterials》上的研究，正是为了突破这一瓶颈。他们设想：能否开发一种新型类器官，既能像天然组织那样，让上皮细胞基底面接触基质、顶面暴露在外，又能提供源自人体组织的、真实的细胞外基质信号，以驱动更完整的细胞谱系分化？答案是肯定的。他们成功创建了名为“脱细胞细胞外基质融入的顶向外气道类器官”（dECM-incorporated Apical-out Airway Organoid， dECM-AoAO）。其核心创新在于，研究人员没有使用传统的水凝胶包埋，而是将人肺组织经过脱细胞处理后研磨成微米级的微粒（dECM-MPs），在类器官自组装初期，就直接将这些富含天然基质成分的微粒与人类支气管上皮细胞混合。细胞在聚集过程中，会将dECM-MPs包裹在内，从而在内部形成一个仿生的基质微环境，同时整个结构的顶面依然朝外。
为了开展这项研究，作者团队运用了几个关键的技术方法。首先，他们利用人尸检肺组织（来自3名无肺部疾病史的捐赠者），通过灌注洗涤剂和酶液进行全肺脱细胞，并经研磨、过滤，制备了尺寸可控的dECM-MPs。其次，他们建立了一套定量化的类器官构建流程，通过精确控制每1000个上皮细胞所混合的dECM-MP数量（最终优化为1000个颗粒），并采用真空过滤来均一粒径，确保了类器官形态的一致性。再者，研究人员开发了基于活体成像和计算机视觉算法的“集群追踪”技术，能够批量、自动地分析由顶面纤毛摆动驱动的整个类器官在二维平面上的运动轨迹和速度，作为评估纤毛功能的直接读数。最后，他们系统评估了该模型对细胞因子白介素-13（IL-13）刺激的响应，并测试了其冻存复苏后的稳定性。
研究结果部分展示了一系列令人信服的发现：
3.1. dECM-MP追踪及剂量依赖的类器官形成
研究人员通过荧光标记证实了dECM-MP成功被整合到类器官中。他们发现，简单地按重量浓度添加dECM-MP会导致类器官形态不规则。通过改用颗粒计数法加载并过滤控制粒径，他们成功优化了条件，使得每个由1000个上皮细胞组成的球体能稳定整合约1000个dECM-MPs，形成结构紧密、形态均一的类器官前体。
3.2. 真空过滤优化dECM-MP输入并改善dECM-上皮球体一致性
使用过滤后粒径更均一的dECM-MPs，并基于颗粒数量（而非重量）进行加载，显著提高了形成的dECM-上皮球体的圆度和一致性。免疫染色显示，上皮细胞（E-cadherin标记）与生物素标记的dECM-MPs在球体内紧密交织，形成了稳定的细胞-基质互作结构。
3.3. dECM-MP的融入促进了气道表皮谱系多样化
与不含基质的传统顶向外类器官相比，dECM-AoAO在分化后展现出了丰富的细胞类型。免疫荧光显示，其内部不仅有标志多纤毛细胞的乙酰化α-微管蛋白，还出现了分泌黏液的杯状细胞（MUC5AC+）、分泌蛋白的克拉拉细胞（SCGB1A1+）以及具有干/祖细胞特性的基底细胞（TP63+）。定量分析证实，dECM-AoAO中分泌细胞和基底细胞的比例显著高于无基质对照组，而表面的纤毛覆盖率则保持不变。更重要的是，从成熟的dECM-AoAO中分选出的基底细胞，在重新培养后能再次形成包含所有主要细胞谱系的类器官，证明了其功能性的干细胞特性被成功保留。
3.4. dECM-MP的融入恢复了AoAO对IL-13的疾病相关性反应
IL-13是哮喘等2型炎症性疾病中的关键细胞因子，能诱导杯状细胞增生和纤毛功能受损。实验发现，用IL-13刺激dECM-AoAO后，其杯状细胞标志物MUC5AC表达显著增加，同时表面纤毛覆盖减少，这完美模拟了体内气道在炎症下的“黏液高分泌”病理特征。相反，无基质的AoAO对相同剂量的IL-13几乎没有反应，凸显了基质信号对于模型病理生理相关性的不可或缺性。
3.5. dECM-AoAO实现了基于纤毛驱动组织运动的无标记功能评估
成熟的dECM-AoAO被转移到平板中后，其外表面朝外的能动纤毛协同摆动，能够驱动整个类器官进行旋转和平移运动。研究人员开发了自动化视频分析流程，可以同时追踪多个类器官（“集群”分析）的运动轨迹并计算速度。当使用纤毛动力蛋白抑制剂EHNA处理后，类器官的运动几乎完全停止，证实了运动完全由纤毛驱动。这为高通量、无创地评估纤毛功能和药物干预效果提供了强大工具。
3.6. dECM-AoAO支持冷冻保存和复苏
实用性是模型推广的关键。研究证实，成熟的dECM-AoAO经过冻存和复苏后，细胞存活率、关键细胞谱系（TP63+， SCGB1A1+， MUC5AC+， Ac-α-tub+）的组成比例均与冻存前无显著差异。虽然复苏后即刻的类器官运动速度有所下降，但在7天内可恢复到冻存前水平。相比之下，无基质的AoAO在复苏后则难以完全恢复运动能力，且组织萎缩更明显，这表明dECM-MP的融入显著增强了类器官的结构和功能稳定性。
结论与讨论部分 归纳了本研究的核心贡献与重要意义。这项研究成功构建了dECM-AoAO这一新型气道类器官模型，它巧妙地整合了“顶向外”的极性便利性与“基质向内”的生理真实性。该模型不仅更准确地复现了天然气道的细胞组成谱系和对病理刺激（如IL-13）的响应，还建立了基于纤毛驱动运动的无标记功能读出方法，并证实了良好的冻存兼容性。这解决了现有模型在模拟上皮-基质相互作用和便捷研究顶面生物学之间的取舍难题。
其重要意义在于：第一，技术整合与创新：它将脱细胞基质技术与顶向外类器官技术相结合，提供了一种模拟组织顶-基底轴双向界面的新策略。第二，增强生理相关性：引入天然来源的dECM-MPs提供了更真实的生化微环境，纠正了无基质模型中谱系单一的缺陷，使疾病建模（如IL-13诱导的黏液高分泌）更具说服力。第三，功能评估便捷化：建立的“集群”运动分析平台，实现了对纤毛功能的高通量、无创量化，为药物筛选和毒性测试开辟了新途径。第四，提升实用性与可扩展性：模型支持冻存，便于存储、运输和标准化应用，提高了其作为研究工具的可用性。尽管使用人源dECM会引入供体间的变异性，但此工作为在类器官中精确重建组织特异性微环境树立了范例，其设计理念可推广至肠道、肝脏等其他组织器官的研究，为深入探究细胞外基质在组织稳态、疾病发生与再生修复中的复杂作用提供了强有力的平台。
