PI(4)P通量对PI(4,5)P2稳态与振荡的差异性影响

《Proceedings of the National Academy of Sciences》：Distinct impact of PI(4)P flux on PI(4,5)P2 steady states and oscillations

本研究借助高速活细胞成像技术，首次在肥大细胞质膜上观察到磷脂酰肌醇4-磷酸（PI(4)P）的周期性振荡波，并揭示了PI(4)P合成速率对下游磷脂酰肌醇4,5-二磷酸（PI(4,5)P2）振荡的关键调控作用。研究表明，PI(4,5)P2的振荡幅值对PI(4)P通量高度敏感，但其稳态水平却能保持稳定。这一发现为理解磷酸肌醇的动态信号传导及其如何调控Rho GTP酶（如Cdc42）与细胞骨架的耦合振荡提供了新的视角。

　　

血浆膜PI(4)P以行波形式存在。

为研究PI(4)P在调节PI(4,5)P₂水平中的作用，研究团队利用全内反射荧光（TIRF）显微技术，以亚秒级的时间分辨率观察肥大细胞质膜上PI(4)P的动力学。通过使用SidM的PI(4)P结合结构域（P4M）构建的荧光探针，在抗原刺激的肥大细胞中观察到了iRFP-P4M荧光的相干行波波前。A) Experimental schematic of TIRF imaging of living mast cells... (B) representative TIRF micrographs of iRFP-P4M fluorescence... (C) Power spectrum of the fluorescence intensity time series...">

振荡峰处的荧光强度相比周围质膜基线增加了约1.8倍。对荧光时间序列的快速傅里叶变换显示，振荡周期约为27.4秒。通过对同一细胞内多个感兴趣区域的分析，证实了振荡在细胞中心区域保持一致，表明P4M行波在频率上是全局同步的，但在空间上是异质的。细胞群体水平的分析显示，P4M振荡的平均周期为28.7 ± 8.6秒，归一化振幅（ΔF/F₀）为0.36 ± 0.02。这些结果表明，质膜PI(4)P存在时空异质性，表现为皮层振荡，同时细胞水平的稳态密度保持稳定。

抑制PI4KIIIα影响PI(4,5)P₂振荡但不影响其稳态水平。

为了评估PI(4)P通量对PI(4,5)P₂动力学的影响，研究团队使用高选择性抑制剂GSK-A1急性抑制了主要的质膜PI(4)P合成酶——磷脂酰肌醇4-激酶IIIα（PI4KIIIα）。通过分析质膜PI(4)P探针iRFP-P4M和PI(4,5)P₂探针iRFP-PH_PLCδ对扰动的反应，发现低至2纳摩尔的GSK-A1足以完全消除局部iRFP-P4M的振荡振幅，并伴随质膜全局荧光强度显著降低53.5%。2... (B) Annihilation of iRFP-P4M oscillations and reduction of baseline intensity induced by 2 nM of GSK-A1... (C) Same as (B), but for iRFP-PH_PLCδ, which shows only a 2% decrease in global intensity...">

对于PI(4,5)P₂，在2纳摩尔GSK-A1处理后，iRFP-PH_PLCδ的行波波前消失，但其全局荧光强度基本保持不变（平均仅降低4.0%），而局部振荡振幅在几个振荡周期内迅速减弱。这些结果表明，质膜PI(4,5)P₂的稳态水平得以保持，但其振荡振幅对质膜PI(4)P的合成速率高度敏感。

磷酸肌醇与Rho GTP酶Cdc42的行波在时空上耦合。

研究进一步假设，PI(4)P和PI(4,5)P₂的振荡与具有下游功能的效应蛋白耦合。一个与PI(4,5)P₂密切相关的蛋白是小型Rho GTP酶Cdc42，它通过与formin和Arp2/3的相互作用在细胞骨架肌动蛋白聚合中发挥作用。研究团队使用Cdc42结合结构域（CBD）传感器检测GTP结合的活性Cdc42（Cdc42-GTP）。活细胞成像显示，CBD-GFP的强劲振荡与iRFP-P4M和iRFP-PH_PLCδ的动态紧密地相位锁定。2 waves. (A) Schematic of the phosphoinositide reaction network coupled to the Cdc42 GTPase cycle... (B) Dual-color TIRF imaging of Cdc42-GTP (CBD-GFP, green) and PI(4)P (iRFP-P4M, magenta)... (C) Same analysis as (B) for dual-color TIRF imaging of Cdc42-GTP (CBD-GFP, green) and PI(4,5)P₂(iRFP-PH_PLCδ, magenta)...">

通过空间-时间图和交叉相关分析发现，CBD-GFP峰值比iRFP-P4M峰值滞后约1秒，而与iRFP-PH_PLCδ的振荡周期高度同步，无检测到的相位差。细胞群体分析表明，PI(4)P振荡与Cdc42相关的生物活动在不同细胞间存在关联性。这些发现表明，在适当的表达水平下，P4M传感器能够检测由微摩尔级通量引起的PI(4)P振荡，并且PI(4)P和PI(4,5)P₂的振荡在时空上与膜结合活性Cdc42的周期一致。

干扰PI(4)P通量可逆地减弱Cdc42振荡并抑制肌动蛋白波。

研究团队通过抑制PI(4)P通量来确定其对Cdc42-GTP和皮层肌动蛋白动力学的影响。在急性加入2纳摩尔GSK-A1之前，CBD-GFP与iRFP-P4M或iRFP-PH_PLCδ的组合均表现出稳健的振荡。加入抑制剂后，iRFP-P4M的振荡振幅和基线强度均降低，而iRFP-PH_PLCδ仅表现出振荡振幅减弱。值得注意的是，CBD-GFP的振荡振幅被消除并恢复到基线强度。Cdc42振荡振幅的衰减是可逆的，在洗去GSK-A1后约2分钟内，CBD-GFP的振荡得以恢复，且振幅和频率相当。

进一步，研究使用丝状肌动蛋白（F-actin）标记物LifeAct评估了PI(4)P通量对皮层肌动蛋白的功能影响。在PI4KIIIα抑制前，LifeAct-mRFPruby的振荡峰值落后于CBD-GFP，但周期相同。在2纳摩尔GSK-A1处理后，LifeAct-mRFPruby的振荡首先减弱，反映了CBD-GFP振荡的衰减，数分钟后崩塌至初始基线以下。α inhibition reduces Cdc42 oscillation amplitude reversibly and dampens actin waves. (A) Schematic illustrating the coupled reaction network of PIP lipids, Rho GTPase Cdc42 and actin... (B) Simultaneous loss of CBD-GFP and iRFP-P4M oscillations under PI4KIIIαinhibition... (C) Time series of CBD-GFP and iRFP-PH_PLCδoscillations... (D) Reversibility of Cdc42 oscillation damping... (E) Time series of CBD-GFP and LifeAct-mRFPruby oscillations...">

这些结果表明，存在一个由PI4KIIIα催化的PI(4)P合成的临界速率，该速率对于维持PI(4,5)P₂、Cdc42和F-actin的振荡是必需的。

讨论。

研究通过结合高速TIRF成像和具有快速脂质周转的分泌细胞模型系统，发现PI(4)P在肥大细胞表面形成周期性行波。在这种振荡状态下，急性抑制质膜PI(4)P合成会同时消除PI(4)P和PI(4,5)P₂的振荡，但以不同的方式扰动它们的稳态水平。振荡性的脂质动力学对Cdc42 GTP酶循环和皮层肌动蛋白振荡产生直接的功能性后果。这些发现强调了在一个能够捕捉稳态和振荡动力学的动态框架内描绘信号脂质及其效应蛋白的重要性。

检测此类振荡动力学需要在活细胞中对脂质通量进行时空精确的测量。本研究中使用的P4M传感器亲和力约为1微摩尔，表明所报告的PI(4)P通量处于亚微摩尔至微摩尔范围。在这一范围之外的PI(4)P通量很可能未被检测到，这意味着PI(4)P振荡的实际普遍性被低估了。

从更广泛的角度看，此类脂质振荡的观察有助于重塑我们对磷酸肌醇稳态的理解。在振荡状态下，即使是最小程度的PI4KIIIα活性抑制也会迅速抑制PI(4)P和PI(4,5)P₂的振荡。这证明了PI(4)P合成对PI(4,5)P₂动力学，进而对其调控的许多下游过程的直接和急性影响。PI(4)P通量对PI(4,5)P₂稳态和振荡的不同影响，可能源于生化适应中时间尺度的分离。适应是系统在响应扰动或刺激后恢复的能力。在这种背景下，PI(4)P和PI(4,5)P₂振荡可能受快速适应回路调控，该回路驱动脂质水平周期性超过和低于稳态水平。而PI(4,5)P₂的稳态则表现出完美的适应，即使PI4KIIIα抑制持续存在，它也能精确恢复到扰动前的稳态水平。此外，PI(4)P的稳态似乎表现出不完美的适应，因为其扰动水平并未完全恢复到初始稳态。由于适应精度和灵敏度可以解耦，PI(4)P可能在快慢两种适应时间尺度上运作。

总之，直接观察脂质振荡能够对适应机制进行分析，从而更准确地反映分子尺度的潜在生化活动。在活细胞中，生化反应嵌入紧密耦合的反馈网络内，产生了更复杂的行为，包括强大的稳态控制。在快速时间尺度上观察，不完美的适应表明了反应网络结构内存在额外的、更慢的调控层。因此，稳态行为的持续转变，通常被隐含地认为是单一生化反应的结果，实际上是非平凡的结果。