通过计算机模拟方法发现并生物评估了一种新型选择性HDAC8抑制剂，该抑制剂具有1-H-吡唑[3,4-b]吡啶骨架结构

《Bioorganic Chemistry》：In silico discovery and biological evaluation of a novel selective HDAC8 inhibitor featuring 1 H-pyrazolo[3,4- b]pyridine scaffold

AI辅助药物设计结合分子模拟筛选出新型HDAC8抑制剂Cmpd.16，其1H-吡唑并[3,4-b]吡啶骨架具有高抑制活性（IC50=0.16±0.01μM），通过诱导凋亡和G2/M期阻滞发挥作用，分子动力学验证了靶点结合模式。

　　

闫文英|史赫|李婷婷|傅岩|张玉莎|张阳|刘杰|李学东

河北医科大学第三医院临床药学系，石家庄050051，中国

摘要

组蛋白去乙酰化酶8（HDAC8）是一种关键的表观遗传调节因子，负责染色质重塑和转录控制。由于其在恶性肿瘤中经常发生失调，因此成为了一个有吸引力的抗癌靶点。然而，由于HDAC亚型之间的结构高度保守，开发选择性抑制剂面临重大挑战。本研究主要利用人工智能（AI）模型和分子模拟技术建立了一个高效的药物筛选流程，并通过酶抑制试验和细胞实验进一步评估了计算优先化合物的生物活性。成功鉴定出一种结构新颖的化合物Cmpd.16，其对HDAC8表现出良好的抑制活性（IC₅₀ = 0.16 ± 0.01 μM），并通过诱导凋亡和G2/M期细胞周期停滞来适度抑制HCT116细胞的增殖。随后，通过分子动力学模拟研究了Cmpd.16在活性口袋中的结合构象，通过自由能分解确定的关键残基进一步阐明了药物-靶标结合模式。总体而言，Cmpd.16具有1H-吡唑[3,4-b]吡啶骨架，通过高效的筛选流程被发现，为合理设计针对HDAC8的抑制剂提供了宝贵的见解。

引言

异常的染色质修饰在多种癌症的发生和发展中起着关键作用[1] [2]。在染色质修饰因子中，组蛋白去乙酰化酶（HDACs）经常表达异常，破坏了组蛋白乙酰转移酶（HATs）和HDACs之间的动态催化平衡[3] [4]。值得注意的是，HDACs不仅作用于组蛋白，还针对非组蛋白底物，调节蛋白质的酶活性和mRNA稳定性，参与重要的生物过程[5] [6]。HDACs在生理过程中发挥着不可或缺的调节作用，如造血系统的形成以及心脏、肌肉和骨骼的发育，因此成为有前景的治疗靶点[7] [8] [9] [10]。HDACs包含18个亚型，分为四类：I类（HDAC1、2、3、8）、II类（IIa：HDAC4、5、7、9；IIb：HDAC6、10）、III类（SIRT1–7）和IV类（HDAC11）。其中，I类、II类和IV类的亚型是锌依赖性酶，而III类亚型则是NAD⁺依赖性去乙酰化酶[6] [11] [12]。

作为I类去乙酰化酶的一种，HDAC8由377个氨基酸组成（42 kDa），具有核/细胞质双重定位特性，在结构特征和生物功能上表现出显著的亚型特异性[13] [14]。HDAC8在人类中位于X染色体上，可以独立发挥作用而无需辅因子。HDAC8催化口袋附近的L1环区域具有高度灵活性和广泛的构象可塑性，为适应多种底物提供了结构基础[15] [16]。关键的是，结构分析表明HDAC8在L1/L6环区域形成了一个开放的亚口袋，这使其在结构上与其他保持闭合构象的HDAC亚型区分开来[15] [17] [18]。这种独特的构象差异也是设计选择性HDAC8抑制剂的关键依据。此外，HDAC8具有底物多样性，不仅能催化组蛋白的去乙酰化，还能催化多种非组蛋白底物的去乙酰化[19] [20]。然而，尽管在体外HDAC8可以脱去核心组蛋白H3和H4的乙酰基，但它们是否在体内真正作为HDAC8的生理底物仍存在争议[13] [21]。

新兴证据表明，多种非组蛋白蛋白是HDAC8的底物，包括染色体结构维持蛋白3、凝聚素、皮质肌动蛋白结合蛋白和雌激素相关受体α，这些蛋白在凝聚素乙酰化周期、端粒维持和颅面发育等生物过程中发挥着关键的调节作用[22] [23]。有力证据还表明，HDAC8的表达异常与多种癌症的起始和进展有关[24]。HDAC8在神经母细胞瘤组织中的表达显著上调，与肿瘤进展晚期和不良临床预后密切相关[17] [25]。此外，HDAC8可能通过AKT/GSK-3β/Snail信号通路促进乳腺癌细胞的转移[21] [26]。选择性HDAC8抑制剂已被证明能在T细胞淋巴瘤细胞中诱导凋亡，显示出良好的抗肿瘤活性[27] [28]。此外，药理学抑制HDAC8可以增加组蛋白H3赖氨酸27（H3K27）的乙酰化水平，并在肝细胞癌（HCC）细胞中重新激活T细胞趋化因子的产生，为将表观遗传重编程与免疫疗法结合治疗HCC提供了理论基础[14] [29]。

已经开发出几种选择性HDAC8抑制剂，包括NBM-BMX、PCI-34051、NCC-149、WK2–16和OJI-1。其中，NBM-BMX是一个领先的候选药物，已进入临床试验阶段，目前正在评估其治疗晚期癌症的效果[15] [30] [31] [32] [33]。报道的选择性HDAC8抑制剂符合广谱HDAC抑制剂的药效团模型，通常由三个结构部分组成：（1）与活性位点口袋边缘相互作用的帽基团（Cap）；（2）与口袋内疏水氨基酸结合的连接部分（Linker）；以及（3）在口袋底部螯合锌离子（Zn²⁺）的锌结合基团（ZBG）[21] [34] [35]。活性口袋的特点是：（1）由L1/L6环形成的开放亚口袋；（2）相对较浅的结合腔拓扑[15] [18]。由于羟胺酸（HAs）具有很强的Zn²⁺螯合能力，长期以来一直是HDAC抑制剂设计的主要成分[36]，大多数传统的优化工作都集中在开发具有不同芳香/杂环骨架的帽基团或引入截短的烷基/芳基连接部分，以提高结合亲和力和选择性[13] [21] [28]。然而，这些策略往往导致骨架多样性有限、结构同质化以及合成复杂性增加。此外，基于对接的虚拟筛选有助于识别生物活性化合物和先导化合物[37] [38] [39]，但存在较高的假阳性率和较高的计算成本，而HDAC亚型之间的结构保守性使得使用传统评分函数难以实现亚型选择性。

随着高性能计算的进步，AI和计算机辅助药物设计（CADD）的协同整合在解决复杂挑战和提高药物发现效率方面具有巨大潜力[40]。本研究建立了一个多标准AI辅助的高效筛选流程，结合了深度学习模型和分子模拟技术（图1）。HDban模型通过学习数据驱动的化合物-蛋白质相互作用（CPI）模式，在早期阶段就引入了亚型选择性约束，减少了非选择性抑制剂的富集。同时，LigBind模型利用基于图神经网络的相互作用学习，快速评估受体-配体兼容性，从而在计算成本高昂的对接和分子动力学模拟之前进行大规模化合物筛选。该流程从数据驱动特征、空间几何互补性和结合自由能等多个维度出发，致力于识别新的化学骨架和结构上有利的帽基团片段，从而加速针对HDAC8的抗癌药物的开发。

部分片段

基于HDban的CPI预测

DrugBAN最初是在多靶点和多类型蛋白质-配体相互作用数据上训练的，证明了其作为CPI预测框架的强大泛化能力[41]。在此基础上，我们开发了一个针对HDAC的CPI预测模型（HDban），实施了迁移学习和微调策略[42]。HDban利用卷积神经网络（CNNs）对一维蛋白质序列进行编码，以捕获局部结构特征，并采用了图卷积

基于深度学习模型的快速筛选

首先，通过整合ChemDiv、ChemBridge、ZINC、Specs和Vitas-M数据库，编制了一个包含约1000万种化合物的化合物库。然后，使用Lipinski和Veber的药物相似性规则进行快速筛选，得到了约977万种分子。之后，使用PAINS-remover工具去除了泛检测干扰化合物（PAINS），最终得到了一个包含约923万种分子的精炼分子库

结论

本研究建立了一个基于AI的集成流程，用于高效发现HDAC8抑制剂，结合了药物相似性评估、化合物-蛋白质相互作用预测、基于深度学习的亲和力评分、层次对接和分子动力学模拟。该筛选流程优先选择了Cmpd.16，它具有新颖的1H-吡唑[3,4-b]吡啶骨架，并表现出高HDAC8结合亲和力。

CRediT作者贡献声明

闫文英：撰写——原始草稿，研究，资金获取，正式分析。史赫：可视化，研究，资金获取，正式分析。李婷婷：验证，研究，正式分析。傅岩：研究，资金获取，正式分析。张玉莎：正式分析。张阳：撰写——审阅与编辑，资金获取。刘杰：撰写——原始草稿，监督，资金获取，概念化。李学东：撰写——审阅与

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

本研究得到了河北省教育厅的科学研究项目（BJ2025046, QN2026533）、河北省医学科学研究项目（20240241, 20220200）、恒瑞-河北创新与发展医疗合作计划（HR202502095, HR202502098）、河北省自然科学基金（H2024206375）、河北医科大学的春雨项目初期资助（CYCZ2023010, CYCZ2023011, CYQD2023012）以及河北燕赵金台人才聚集计划骨干人才的支持

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。