《Bioorganic Chemistry》：Discovery of small-sized tris-aryl imidazoles as bifunctional ligands for c-Myc and KRAS G-quadruplexes
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肿瘤生长促进依赖于c-Myc和KRAS内源性通路的重叠，双靶向治疗成为药物研发的新方向。三芳基咪唑类化合物HZ-1被证实能高选择性结合c-Myc和KRAS的平行G4发夹结构，通过激活NRF2-XCT-GPX4通路诱导铁死亡、凋亡和免疫原性细胞死亡，抑制MDA-MB-231乳腺癌细胞增殖，并在携带4T1癌细胞的BALB/c小鼠中展现显著肿瘤抑制效果，同时促进CD8+和CD4+ T细胞浸润。
Xue-Zhang Liu|Xiao-Dong Wang|Ming-Hao Hu
深圳大学医学院药学院国际癌症中心合成生物学国家区域工程实验室，中国深圳518055
摘要
肿瘤生长的促进是由于c-Myc和KRAS内在通路的重叠，而双靶点疗法成为药物发现中一种有前景的方法。c-Myc和KRAS基因的启动子区域存在G-四链体（G4s），这导致了转录抑制。近年来，G4配体受到了广泛研究，但双靶点配体仍处于早期阶段。因此，我们设计并合成了三芳基咪唑类似物，并首次确认了它们与c-Myc和KRAS G4s的结合特性。HZ-1被证明是对平行G4s具有相对选择性的最有前景的结合剂。随后，在人类乳腺癌MDA-MB-231细胞中通过NRF2-XCT-GPX4通路验证了HZ-1的抗肿瘤效果，该效果表现为铁死亡、凋亡和免疫性细胞死亡（ICD）。最后，在BALB/c小鼠体内，HZ-1表现出强烈的肿瘤生长抑制作用，且对小鼠没有显著的不良影响。HZ-1还促进了脾脏和肿瘤中CD8+细胞毒性T淋巴细胞和CD4+辅助T淋巴细胞的增殖。总之，HZ类似物与多个G4s的相互作用为抗癌策略提出了一个新的概念。
引言
KRAS蛋白是实体瘤中最常见的异常之一，其突变和扩增限制了GTP向GDP的水解，从而维持了下游信号通路的激活[1]、[2]。KRAS不仅通过启动细胞增殖和分化促进肿瘤发生，还通过调节免疫系统[3]、[4]促进肿瘤进展。尽管最近FDA批准了针对KRAS G12C突变的抑制剂，但仍需要探索能够抑制多种KRAS突变体的小分子抑制剂[5]、[6]。此外，c-Myc是另一种常被激活的致癌基因，它通过调节基因转录在多种细胞过程中起关键作用，如增殖、衰老和血管生成[7]、[8]。与大多数KRAS突变体一样，c-Myc目前没有获批的靶向药物，部分原因是其结构域无序且位于细胞核内难以接触[9]。
Myc和RAS在生物学上是可区分的且相互依赖的：Myc是细胞核内的转录因子，而RAS通过细胞质中的磷酸化级联反应调节蛋白质信号传导[10]、[11]。就乳腺癌而言，Myc和RAS的表达共同作用会增加乳腺肿瘤灶的形成频率。Myc和RAS可能通过重叠机制维持肿瘤发生并促进肿瘤生长，包括肿瘤细胞的内在通路以及对免疫细胞的调节[12]。例如，在某些腺癌中，c-Myc和KRAS的共激活会引发炎症和免疫抑制环境[13]。因此，同时抑制这两种致癌基因代表了一种非常有前景的治疗策略。一个例子是，在小鼠乳腺癌模型中，同时失去这两种致癌基因会导致肿瘤显著缩小和更长的生存时间[14]。
基于上述发现，在基因水平上同时针对c-Myc和KRAS的多靶点治疗为肿瘤治疗提供了有利的机会。G-四链体（G4s）是一种独特的四链核酸结构，通常由端粒和基因（如c-Myc、KRAS和c-Kit）启动子中的鸟嘌呤富集序列形成[15]、[16]。由于它们具有转录抑制作用，稳定癌基因G4s成为癌症治疗的一种有前景的策略[17]。例如，基于喹啉的配体能够靶向c-Myc和KRAS G4s，并在体外和体内显示出抗肿瘤效果[18]。我们的研究小组致力于发现针对G4s的小分子配体并阐明其相关机制。已经鉴定出与KRAS启动子G4结合的咪唑衍生物可以抑制癌症生长并增强免疫调节[19]。长链取代的喹诺酮类化合物通过与c-Myc G4的相互作用引发DNA损伤并激活cGAS-STING通路[20]。此外，还开发了一些同时针对c-Myc和Bcl-2 G4的双靶点配体[21]、[22]。
在这项研究中，我们发现了一组三芳基咪唑类似物，通过荧光猝灭实验和荧光共振能量转移（FRET）实验研究了它们与c-Myc G4和KRAS G4的相互作用。结合对多种肿瘤细胞的细胞毒性，HZ-1被筛选为最有前景的配体。在人类乳腺癌MDA-MB-231细胞中，HZ-1促进了G4的形成，并通过诱导铁死亡、凋亡和免疫性细胞死亡（ICD）发挥肿瘤杀伤作用，其中NRF2-XCT-GPX4通路被确定为关键途径。最后，在携带小鼠乳腺癌4?T1细胞的BALB/c小鼠中，HZ-1表现出抗增殖和免疫调节作用，包括激活CD8+和CD4+ T细胞。
三芳基咪唑类似物的设计与合成
咪唑基团在生物活性分子中普遍存在，是抗癌、抗菌和抗炎药物中的关键药效团。我们的研究小组开发了芳香基取代的咪唑衍生物作为有效的G4配体。然而，之前的结构往往具有较高的分子量和不理想的药物特性，限制了它们的转化潜力。为了解决这些问题，我们设计了一系列结构紧凑的三芳基咪唑化合物。
结论
在临床实践中，仅针对单一靶点的药物通常不足以完全控制疾病。因此，针对多靶点的G4结合剂为抗肿瘤剂的发现提供了新的思路。本文设计并合成了一组三芳基咪唑类似物，并通过荧光猝灭实验和FRET实验分别确定了它们与c-Myc启动子G4和KRAS启动子G4的结合和稳定能力。
荧光猝灭实验
荧光猝灭实验使用Hitachi F-4600荧光分光光度计进行，使用了5′-TAMRA标记的c-Myc G4和KRAS G4序列。目标序列（200?nM）置于Tris-HCl缓冲液（10?mM，pH?7.4，含有100?mM KCl）中，并逐渐加入化合物储备液，最终浓度达到10?μM。每次添加后记录荧光光谱。所有测量均重复三次。表观解离常数KD值如下：
CRediT作者贡献声明
Xue-Zhang Liu：实验研究。Xiao-Dong Wang：撰写初稿、资金筹集。Ming-Hao Hu：撰写、审稿与编辑、实验研究、资金筹集、概念构思。
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
致谢
本研究得到了深圳科技计划（JCYJ20230808105509018和JCYJ20250604181732042）的支持。我们还要感谢深圳大学仪器分析中心提供的共聚焦成像实验和NMR测试支持。
