一种近红外无串扰FRET荧光探针，用于高特异性检测亚硫酸盐和粘度，同时具有多种应用前景

《Bioorganic Chemistry》：A near-infrared crosstalk-free FRET fluorescent probe for highly specific detection of sulfite and viscosity as well as its multi-applications

硫氧双探针PPTC通过FRET技术实现SO2和粘度双响应检测，发射峰分离250nm消除光谱干扰，灵敏度达61.88nM，在食品、环境、细胞等多场景验证有效。

　　

邓彤|肖慧泉|洪嘉欣|夏新宇|杨五英|段柳英|尹晓丽|刘胜兰|洪艳萍

江西农业大学食品科学与工程学院天然产物与功能食品重点实验室，中国南昌330045

摘要

二氧化硫（SO₂）在生物系统中作为关键的信号分子，在食品中常用作防腐剂；而粘度变化则反映了病理状态和植物应激反应中的微环境变化。为了解决这两种分析物的检测难题，研究人员通过将菲并咪唑供体与哌嗪-苯-噻吩-花青素受体结构结合，设计了一种近红外FRET探针PPTC。这种工程化的探针实现了250纳米的显著发射分离（510/760纳米），有效避免了光谱串扰，并融入了双响应比率测量机制：亲核C=C键断裂在4分钟内引发了510纳米处的明显增强，而粘度限制的旋转则增强了760纳米处的发射。基于这种双响应设计，探针对SO₂的检测灵敏度达到了纳摩尔级别（61.88 nM）。功能验证涵盖了多个领域，包括食品安全监测（在干燥样品中SO₂的回收率为95.33–103.33%）、利用智能手机-水凝胶平台进行的环境监测、研究盐胁迫下水稻芽中的粘度与SO₂的协同调节，以及检测洋葱表皮中的细胞屏障穿透情况。通过线粒体共定位（皮尔逊系数0.87）和斑马鱼及活细胞中的炎症追踪，进一步证明了该探针在跨物种环境中的双重检测能力。

引言

二氧化硫（SO₂）是一种常见的大气污染物，它通过氧化驱动的反应引发关键的环境连锁反应[1]。溶解于水系统后，SO₂迅速水解生成活性亚硫酸盐（SO₃^2?/HSO₃^?），这些物质会催化酸沉降过程[2],[3]，从而导致酸雨，进而通过土壤酸化、微量营养素流失和直接的植物毒性影响农业可持续性，最终促使SO₂衍生物进入食物链[4]。尽管存在这些生态威胁，SO₂在食品技术中仍作为多功能添加剂不可或缺[5],[6]：其强还原能力使其应用于抑制脱水水果的酶促褐变、稳定葡萄酒等发酵饮料中的微生物等。然而，过量使用或长期摄入这类产品会增加体内SO₂积累的风险，这与组织氧化应激和亚硫酸盐介导的蛋白质加合物形成有关[7],[8]。

除了环境和工业用途外，新兴研究还揭示了SO₂衍生物在生物体中的浓度依赖性生物学作用[9],[10]：在植物系统中，低浓度的SO₃^2?/HSO₃^?作为氧化还原信号介质，激活抗氧化防御途径（如过氧化物酶和过氧化氢酶的上调），减轻非生物胁迫引起的氧化损伤[11]，从而提高作物的抗逆性并可能影响农产品的产后保存[12]。相反，在哺乳动物生理学中，生理浓度下的内源性SO₃^2?/HSO₃^?作为气体信号分子，通过平滑肌松弛调节血管张力并抑制促炎级联反应[13]；但高浓度则可能破坏代谢稳态，加剧哮喘、高血压和胰岛素抵抗等病理状况[14]。这种剂量依赖性的双重效应凸显了SO₂衍生物在生物界中的关键而矛盾的作用。鉴于SO₂衍生物作为环境污染物、食品添加剂和生物活性分子的复杂多重身份[15]，开发高灵敏度和时空分辨率的分析平台对于实时监测不同生物尺度上的SO₃^2?/HSO₃^?浓度至关重要，从而深入探索其从农业系统到亚细胞环境的双相行为[16],[17]。

传统的SO₂检测方法主要依赖于色谱和电化学技术，侧重于“从农场到餐桌”的过程监测[18],[19],[20]；相比之下，许多报道的荧光探针实现了从“农场到餐桌再到细胞”的全面监测，采用非侵入性、实时可视化技术[21]，这种方法论进步促进了污染源识别、添加剂残留量测定和活细胞成像下的病理评估[22],[23]。最近的发展加速了荧光探针在食品和环境基质中检测SO₂的应用，尤其是因为它们具有快速且灵敏的荧光响应。例如，针对食品分析设计的单信号激活探针或基于特定分子框架的双重食品/环境应用探针已在目标场景中证明了有效性[24],[25]；然而，这些探针仍易受环境干扰（如光照波动和探针浓度变化）[26],[27]。与简单的单信号“开启/关闭”系统相比，利用双通道发射变化的比率测量荧光探针通过持续自校准最小化了信号干扰，显著提高了检测准确性和灵敏度。显然，基于F?rster共振能量转移（FRET）的荧光探针正好满足了这一需求[28],[29]。

细胞质粘度是控制生物分子扩散、细胞器运动和代谢效率的基本生物物理参数[30],[31]；高粘度与哺乳动物的病理状态和植物的功能障碍密切相关，阻碍了信号传导和代谢物运输等关键过程[32],[33]。偏离生理粘度水平是氧化应激严重程度的公认诊断标志物。因此，开发能够在亚细胞分辨率下实现精确实时粘度绘图的荧光探针至关重要。F?rster共振能量转移（FRET）系统因其内在的比率测量荧光输出和微环境响应能力而成为有前景的传感策略[34]。

尽管已经开发了许多基于FRET的探针，但它们的比率测量信号仍易受光谱串扰的影响，从而影响检测的可靠性。为解决这一限制，需要创新策略来分离发射信号。近红外发射探针提供了一种变革性的解决方案，利用了两个固有的光学优势：显著增大的斯托克斯位移将激发和发射事件在空间上分开，消除了背散射伪影；并且工作在近红外光谱区域，降低了自荧光背景，减少了基质干扰。这种协同的双重机制本质上提高了复杂分析系统中的检测准确性和灵敏度[35]。

考虑到通过空间通道隔离抑制光谱串扰的必要性，设计并合成了一种无串扰的FRET基近红外荧光探针PPTC用于检测SO₂。在探针PPTC的骨架中，使用4-(1H-菲[9,10-d]咪唑-2-基)苯荧光团作为FRET能量供体，FRET能量受体通过1,3,3-三甲基吲哚与独特设计的FRET桥（包含共价连接的噻吩和4-(哌嗪-1-基)苯甲醛）缩合而成。引入噻吩扩展了FRET能量受体的共轭，使其荧光发射红移至近红外区域的760纳米。在与SO₂反应后，探针PPTC在760纳米处的发射强度显著降低，同时在510纳米处的短波长荧光增强。760纳米和510纳米发射峰之间的250纳米分离确保了几乎不存在光谱重叠，从而实现了无串扰的FRET比率测量检测，提高了可靠性。此外，在低粘度环境中，由于CC单键》之间的自由旋转驱动的扭曲分子内电荷转移（TICT）非辐射衰减，PPTC的荧光减弱；而在高粘度微环境中抑制TICT效应后，FRET效率恢复，导致近红外荧光发射显著增强。此外，PPTC的分子结构策略性地包含了一个阳离子吲哚基团，它同时具有FRET传感的电子接受组分和电荷驱动的线粒体靶向模块的功能，能够通过不同的发射响应同时检测线粒体中的SO₂波动和粘度变化。因此，探针PPTC能够在食品和环境水样、活HeLa细胞、斑马鱼、洋葱和水稻芽等各种场景中实现无串扰的SO₂浓度比率测量检测，同时有效感知动物和植物模型中的粘度变化。

材料与方法

所有有机试剂均为分析级，购自商业渠道（Bide Medicine、Energy Chemical和Tansuo平台），无需进一步纯化。探针PPTC的合成路线如图1所示。提供了新化合物的详细通用数据（¹H NMR、¹³C NMR、HRMS）[36],[37]，以及PPTC用于分析物检测和生物成像应用的具体实验方法和程序

设计并合成了PPTC

开发无光谱串扰的近红外发射探针是生物分析化学中的关键目标，因为这类探针能够在最小背景干扰下实现深层组织成像，并提供内在自校准的比率测量信号。为实现这一目标，新型FRET荧光探针PPTC采用了菲[9,10-d]咪唑作为FRET能量供体，因其卓越的荧光量子产率和较大的斯托克斯位移

结论

通过策略性地引入延长的哌嗪-苯-噻吩π-共轭桥，开发了一种新型FRET荧光探针PPTC，实现了无串扰的SO₂衍生物和粘度比率测量检测。该探针实现了三个突破性特性：前所未有的250纳米发射峰分离，消除了510纳米和760纳米通道之间的光谱重叠；以及通过亲核CC

CRediT作者贡献声明

邓彤：撰写——原始草案，研究，数据整理。肖慧泉：验证，数据整理。洪嘉欣：撰写——审阅与编辑，监督，概念化。夏新宇：可视化，数据整理。杨五英：方法学，研究。段柳英：可视化，概念化。尹晓丽：资源获取，概念化。刘胜兰：资源获取，形式分析。洪艳萍：撰写——审阅与编辑，监督，项目管理，资金申请，

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

本研究得到了国家自然科学基金（编号：61965011、62265008）的资助。