亲电弹头与基于苯并噻唑的假定共价抑制剂的结构-活性关系：这些抑制剂针对SARS-CoV-2的主要蛋白酶

《Bioorganic Chemistry》：Electrophilic warhead engagement and structure-activity relationship of Benzothiazole-based putative covalent inhibitors targeting SARS-CoV-2 Main protease

SARS-CoV-2的Main Protease（Mpro）是关键抗病毒靶点，本研究设计合成了苯并噁唑啉类衍生物。化合物35（IC50=0.026 μM）表现最优活性，选择性指数达10,653.8，且急性毒性低（LD50=947.6 mg/kg）。分子对接和模拟显示其通过氢键和疏水作用稳定Mpro活性口袋，降低肝毒性风险。

　　

Sofia Kanwal|Anees Saeed|Ayesha Tahir|Muhammad Shah|Fahad Hussain|Muhammad Yaqoob|Huaiji Zheng|Muhammad Ikram|Abbas Hassan|Umer Rashid

巴基斯坦阿伯塔巴德COMSATS大学化学系，邮编22060

摘要

< />^pro）是一个经过验证的药理靶点。本研究设计、合成并评估了一系列基于苯并噻唑的衍生物作为M^pro抑制剂。合成的5-硝基苯并噻唑中间体（26–29）显示出中等的M^pro抑制活性，并具有低至中等的细胞毒性（在HEK-293细胞中的CC??为16–83 μM）。随后，通过结合位点分析指导的SAR研究对这些化合物进行了优化。优化后得到了高效力的衍生物，特别是化合物35（IC₅₀ = 0.026 μM），其效力优于GC376，并且具有极高的选择性指数（SI）（10,653.8），表明其具有良好的效力和安全性。急性口服毒性研究表明，化合物35（LD₅₀ = 947.6 mg/kg BW）和48（LD₅₀ = 274.6 mg/kg BW）属于IV类和III类毒物，说明其急性口服毒性较低。组织病理学分析显示，中间体化合物28引起了肝脏病变，而最终通过SAR优化得到的化合物35则保持了肝脏结构，没有明显的病理变化。分子对接分析表明，这些苯并噻唑衍生物通过稳定的氢键和疏水相互作用有效地占据了M^pro活性位点的亚口袋，从而促进了催化二聚体的结合和口袋的适应性。化合物35的共价对接显示其与Cys145有良好的结合和潜在的共价相互作用。分子动力学模拟证实，与无蛋白形式的蛋白质相比，化合物35稳定了蛋白质结构，提高了紧凑性，增强了相互作用，并减少了构象波动。总体而言，这些发现表明基于苯并噻唑的骨架是很有前景的SARS-CoV-2 M^pro抑制剂。

引言

^pro，nsp3的一部分）和主要蛋白酶（M^pro, nsp5）[13]。在复制过程中，病毒多聚蛋白在特定位置被M^pro切割，产生具有功能的蛋白质[14]。 M^pro被认为是一个有利的药理靶点，因为它在病毒复制中起着关键作用，并且与其他病毒蛋白相比具有极低的突变变异率[15]。结构上，M^pro包含三个不同的结构域：域I（残基8–101）、域II（残基102–184）和域III（残基201–303）。位于域I和II之间的催化二聚体（Cys145-His41）通过一系列亚口袋（S1、S1′、S2和S3）协调蛋白水解[16]。在这个二聚体中，半胱氨酸残基作为亲核中心，促进共价催化和底物切割[17],[18]。目前，全球的研究工作主要集中在开发具有最佳药物特性、良好药代动力学和最小毒性（例如降低肝毒性）的抗病毒治疗药物，以有效缓解COVID-19的负担。几种重新开发的抗病毒药物，包括洛匹那韦（1）、扎那米韦（2）和印地那韦（3），已显示出对M^pro的抑制活性，并最初被研究作为治疗选项（图1a）[19]。最近，FDA批准的M^pro抑制剂取得了重要进展：Paxlovid（4，由PF-07321332（Nirmatrelvir，4.1）和利托那韦（4.2）组合而成）是2021年首个获得FDA批准的口服抗病毒药物，而Ensitrelvir（5, S-217622）于2022年11月在日本获得了监管批准。2023年，SIM0417获得了中国国家药品监督管理局（NMPA）的授权，尽管其详细化学结构尚未公开[20]。除了这些已批准的药物外，还有许多临床候选药物正在积极评估中，如Ebselen、Masitinib、EDP235、PF-00835231和PBI-0451，以及几种非肽类模拟抑制剂GRL-1720、Z175991356和CCF0058981。PF-07817883（Ibuzatrelvir，6）是一种第二代口服活性M^pro抑制剂，基于Nirmatrelvir合理设计，目前正处于临床开发阶段，作为治疗SARS-CoV-2感染的有希望的药物（图1b）。（见图2。） 在新兴的骨架中，苯并噻唑衍生物是一种结构特殊的杂芳香框架，由融合的苯环和噻唑环组成。这些化合物已被广泛研究其在多种病理条件下的治疗潜力，包括肿瘤学、神经退行性疾病（如阿尔茨海默病和帕金森病）和传染病。2020年进行的初步体外研究表明，某些苯并噻唑类似物对SARS-CoV-2 M^pro具有强大的抑制活性，表明它们作为COVID-19治疗的新化学类型具有潜力。然而，需要进一步的严格临床前和临床研究来验证它们的安全性、药理疗效和转化可行性。 一种基于苯并噻唑的衍生物（7）对SARS-CoV-2 M^pro表现出显著的抑制效力，IC₅₀为0.010 μM，在50 μM时可达到100%的抑制效果[21]。此外，两种卤素取代的类似物，即4-氯苯并噻唑衍生物（8）和4-溴苯并噻唑衍生物（9），也对M^pro表现出明显的抑制活性（图1b）。值得注意的是，化合物8的效力与TKB245相当，而化合物9的活性略有减弱，这可能是由于溴取代基在活性位点P1亚口袋中的空间和电子影响。重要的是，这两种衍生物8, 9在细胞实验中显示出最小的细胞毒性（图1c），表明它们作为治疗开发的可行先导骨架具有潜力[22]。

设计思路

设计理由

先前的研究表明，基于苯并噻唑的化合物对M^pro具有显著的抑制潜力。一些M^pro抑制剂，包括瑞德西韦和洛匹那韦/利托那韦，具有显著的肝毒性。本研究的目的是开发具有最小或无肝毒性的高效苯并噻唑基M^pro抑制剂。先导优化和新的结构框架依赖于对受体结合位点的理解。基于苯并噻唑的化合物被设计并进行对接

结论

本研究总结了新型基于苯并噻唑的化合物作为潜在SARS-CoV-2 M^pro抑制剂的设计和合成。这里概述的先导优化和新的结构框架依赖于对受体结合位点的理解。通过分析M^pro-配体复合物和活性位点亚口袋（S1、S1′、S2和S3）的三维晶体结构，确定了关键相互作用。体外分析和对接研究支持了设计和优化

材料与方法

实验工作遵循标准实验室协议进行，以确保结果的准确性和可重复性。本研究使用的材料、仪器和一般程序如下所述。

CRediT作者贡献声明

Sofia Kanwal：撰写——原始草稿，研究。 Anees Saeed：撰写——原始草稿，研究。 Ayesha Tahir：形式分析。 Muhammad Shah：研究。 Fahad Hussain：方法学，研究。 Muhammad Yaqoob：方法学，研究。 Huaiji Zheng：验证，监督。 Muhammad Ikram：研究。 Abbas Hassan：撰写——审稿与编辑，监督，资金获取。 Umer Rashid：撰写——审稿与编辑，撰写——原始草稿，软件，方法学。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

作者衷心感谢UAEU通过启动研究基金（G00005068）提供的财政支持。