《Bioorganic & Medicinal Chemistry》：Inhibition of amyloid formation of keratin-derived peptide by rosmarinic acid
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淀粉样皮肤角质蛋白KT5–6的鼠尾草酸抑制效应及毒性评估研究。首次证实鼠尾草酸通过结合KT5–6单体抑制其淀粉样沉淀形成，并发现KT5–6淀粉样体毒性较低，为皮肤淀粉样病PLCA的防治及化妆品开发提供新依据。
平尾春香 | 渡边隆弘 | 林智
日本爱媛县松山市文京2-5，爱媛大学科学与工程学院化学与生物学系，790-8577
摘要
原发性局限性皮肤淀粉样变性（PLCA）是由于角蛋白淀粉样物质在皮肤中沉积引起的，会导致严重的症状。PLCA很难完全治愈；因此，预防至关重要。在本研究中，通过使用迷迭香等植物中含有的多酚类物质迷迭香酸（RA），成功抑制了由角蛋白衍生的致淀粉样肽KT5–6的淀粉样形成。研究还表明，RA可以结合KT5–6单体并防止其进一步聚集。该研究还提供了关于KT5–6淀粉样物质的基本信息，如其二级结构和细胞毒性，这些信息可为PLCA的进一步研究提供基础。我们的结果也有助于开发利用RA来预防PLCA的化妆品。
引言
淀粉样物质是由错误折叠的蛋白质自组装形成的纤维状聚集体，具有层叠的β-折叠结构和非分支的针状形态。淀粉样物质通常具有毒性，其在细胞内、细胞外和组织中的异常积累会导致称为淀粉样变性的器官功能障碍。1., 2., 3. 到目前为止，已有超过20种蛋白质与淀粉样变性相关，包括β-淀粉样蛋白（Aβ）和α-突触核蛋白。3., 4. Aβ聚集体在大脑中的积累被认为是阿尔茨海默病（AD）的原因，因为Aβ淀粉样物质及其中间寡聚体会导致神经元和突触的退化。5., 6. α-突触核蛋白淀粉样物质在大脑中的积累也被认为会由于神经元死亡而引发帕金森病（PD）。7., 8. 这些疾病可能导致认知障碍或运动症状；因此，抑制淀粉样物质的形成在临床上非常重要。
根据淀粉样物质形成的部位，淀粉样变性可分为系统性淀粉样变性和局限性淀粉样变性。最常见的四种系统性淀粉样变性类型是轻链淀粉样变性（AL）、炎症性淀粉样变性（血清淀粉样蛋白A（AA））、透析相关性淀粉样变性（β2-微球蛋白淀粉样变性（Aβ2M）和遗传性/老年性淀粉样变性（转甲状腺素淀粉样变性（ATTR）），这些淀粉样物质在全身各种器官中的沉积会导致系统性器官功能障碍。9）局限性淀粉样变性有多种形式，例如大脑中的阿尔茨海默病、胰岛淀粉样变性和垂体中的催乳素淀粉样变性，所有这些都会导致器官功能障碍。10., 11. 在局限性淀粉样变性中，原发性局限性皮肤淀粉样变性（PLCA）的特点是淀粉样物质特异性地沉积在皮肤中，其中最常见的形式是苔藓样淀粉样变性。12., 13. PLCA通常发生在中年男性和女性中。一旦发生PLCA，它会导致各种皮肤病变，如丘疹、斑块、结节、皮肤萎缩、网状图案、紫癜、水疱和色素减退，常伴有严重的瘙痒。对于这些严重症状，通常使用全身抗组胺药和局部类固醇治疗来缓解皮肤症状；然而，实现根本治愈仍然很困难，因此预防（即抑制淀粉样物质的形成）至关重要。
另一方面，关于PLCA的研究，包括对淀粉样物质形成和抑制的研究还不够充分。之前一项分析PLCA患者皮肤的研究表明，角蛋白5–14（KT5–KT14）是淀粉样物质沉积的主要成分。12> 角蛋白是异二聚体蛋白；特别是KT5和KT14分别形成稳定的二聚体和四聚体亚单位，形成的纤维会自组织成交联网络。13> KT5–KT14存在于表皮基底层细胞中，在维持结构完整性和提供保护方面发挥作用。此外，研究表明，在从KT5–KT14衍生的14个序列中，角蛋白5–6（KT5–6）（YQELMNTKLALDVEIATYRKLLEGE）具有最高的致淀粉样潜力。12> 因此，在本研究中，使用标准方法（包括硫黄素T（ThT）测定、透射电子显微镜（TEM）观察和圆二色性（CD）测量）对角蛋白衍生物KT5–6的淀粉样形成进行了基础分析。首次使用MTT测定和活/死锥虫蓝排除测定评估了KT5–6淀粉样物质的细胞毒性。我们还研究了多酚类物质迷迭香酸（RA）对KT5–6淀粉样形成的抑制作用。多酚类物质包含一个或多个芳香酚环，已知具有很强的抗氧化活性并能抑制淀粉样物质的形成。RA是一种天然多酚，在植物中含量较高。据报道，RA可以抑制Aβ和α-突触核蛋白等蛋白质的淀粉样聚集，14> 这些蛋白质被认为是阿尔茨海默病和帕金森病的原因。
在本研究中，使用多种传统方法证明了KT5–6的淀粉样形成，并实现了RA对淀粉样形成的抑制作用。RA具有抗氧化、抑制皮肤衰老和美白等美容效果。鉴于RA是一种小分子，可以直接掺入药物配方中，如果它对角蛋白淀粉样物质的聚集具有抑制作用，预计将其纳入未来药物中将同时实现美容效果和广泛预防PLCA的目标。
材料
合成肽KT5–6（YQELMNTKLALDVEIATYRKLLEGE（453–477）购自Biologica（日本名古屋；纯度>95.0%）。六氟异丙醇（HFIP）购自东京化学工业（TCI，日本东京）。HCl、三氟乙酸（TFA）、RA、甘氨酸和二甲基亚砜（DMSO）购自富士胶片和Wako纯化学（日本大阪）。NaOH购自Nacalai Tesque（日本京都）。PBS（磷酸盐缓冲液）购自Takara Bio（日本滋贺）。
结果
首先，我们使用ThT测定确认了KT5–6的淀粉样形成，该测定可以估计积累的β-折叠结构。孵育后的KT5–6在495 nm处的强度高于单体样本，表明形成了淀粉样物质（图1a）。使用SEM观察到孵育样本中的针状纤维结构，进一步支持了淀粉样物质的形成（图1b）。此外，还获得了圆二色性（CD）光谱以评估KT5–6样本的二级结构（图1c）。
讨论
在本研究中，研究了RA对KT5–6淀粉样形成的抑制作用。值得注意的是，本研究首次对KT5–6淀粉样物质进行了详细表征，包括毒性测定。我们发现RA有效地抑制了KT5–6淀粉样物质的聚集，这可能是由于RA与KT5–6单体之间的相互作用。先前使用核磁共振（NMR）的研究支持了RA与单体蛋白的结合；RA可以结合Aβ单体。
结论
在本研究中，我们首次证明了多酚类物质RA能够抑制KT5–6的聚集，KT5–6是皮肤角蛋白蛋白中的致淀粉样序列，被认为是PLCA的主要成分。据推测，RA通过与KT5–6单体的结合来防止其进一步聚集。本研究还首次证明KT5–6淀粉样物质的毒性较低。在未来的研究中，需要使用全长人角蛋白进行评估。我们的结果将有助于……
作者贡献声明
平尾春香：撰写 – 审稿与编辑、撰写 – 原稿、可视化、验证、方法学、研究、正式分析。渡边隆弘：方法学、研究。林智：撰写 – 审稿与编辑、撰写 – 原稿、可视化、验证、监督、项目管理、方法学、研究、资金获取、概念化。
资助
本工作得到了MEXT/JSPS KAKENHI（资助编号：19H92527、22K19114和2326471）和爱媛大学（先进纳米生物分析研究单元）的支持。
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
