开源性原位光交联挤出生物打印喷头附件的研发：提升水凝胶基质打印精度与细胞活性的新策略

《Bioprinting》：Development of open-source in situ photocrosslinking printhead attachments for extrusion bioprinting of hydrogel matrices

本研究致力于解决挤出式生物打印中，光交联水凝胶（如GelMA）因低粘度和温度依赖性导致的打印精度差和结构稳定性不足的难题。研究人员研发了一种开源性原位光交联打印头附件（ISX-Linker），适配于商业化BioX?生物打印机。该系统通过特定波长（405 nm）光在挤出过程中即时交联，成功使用低粘度生物墨水打印出高保真度结构，并在负载间充质干细胞（MSCs）的GelMA中维持了高细胞活性。这项工作为组织工程提供了可定制、低成本的高精度生物打印解决方案。

　　

在组织工程的奇妙世界里，科学家们一直梦想着像3D打印一样，精准地“搭建”出包含活细胞的复杂人体组织。挤出式生物打印正是实现这一梦想的关键技术之一，它通过层层堆叠含有细胞的水凝胶“生物墨水”来构建三维结构。其中，光交联水凝胶，如明胶甲基丙烯酰胺（GelMA），因其良好的生物相容性和可调控的物理化学性质而备受青睐。然而，一个长期困扰研究人员的难题是：这些水凝胶材料，尤其是那些粘度较低或对温度敏感的种类，在打印过程中往往难以保持理想的形状，打印出来的结构容易塌陷或变形，严重限制了复杂组织模型的构建。传统的解决方法，如打印前预交联或打印后整体光照交联，要么会增加对包裹细胞的剪切应力，影响其存活，要么需要高粘度的生物墨水，牺牲了打印的精细度。

那么，有没有一种方法，能在生物墨水被挤出的瞬间就将其“定型”，从而兼顾高打印精度和高细胞活性呢？发表在《Bioprinting》上的这项研究，给出了一个巧妙且开源的答案。为了克服现有原位光交联技术设备专用性强、兼容性不足的问题，研究团队将目光投向了广泛使用的商业化生物打印机平台。他们的核心目标是：为CELLINK BioX?这款主流的桌面级3D生物打印机，开发一套即插即用、开源可定制的原位光交联打印头附件系统。

研究人员开展这项研究主要依赖于几个关键技术方法：首先是附件设计与制造，他们利用3D CAD软件设计了适配BioX?标准气动和温控打印头的ISX-Linker附件，并通过光固化（SLA）3D打印制造。其次是计算模拟，他们使用ANSYS Speos软件对405 nm LED的光强分布进行了3D模拟，以预测和优化光照效果。再者是生物墨水配方与流变学表征，研究采用了两种代表性光交联水凝胶：10% (w/v) GelMA（含0.25% LAP光引发剂）和10% PEGDA/2.5% Alginate（含0.25% LAP），并利用流变仪分析了不同光强下的交联动力学。此外，3D生物打印与打印性分析是核心验证步骤，他们在BioX?上安装ISX-Linker附件，打印了交叉网格等结构，并通过图像分析计算打印性指数（Pr）来量化形状保真度。最后是细胞实验与力学测试，他们将人间充质干细胞（MSCs，来源于Tulane University的正常成人供者骨髓）封装在GelMA中进行打印，通过活死染色评估细胞活性，并使用微力学测试仪（CellScale Microtester G2）测量打印单纤维的杨氏模量以评估力学性能。

研究结果部分揭示了ISX-Linker系统的有效性与优势：

3.1. 用于CELLINK BioX?的ISX-Linker系统

研究人员成功开发了两款ISX-Linker附件，分别兼容BioX?的标准气动和温控打印头。附件设计包含可手动调节的侧臂执行器，能够精确定位两个405 nm LED光源，使其光束聚焦于打印喷嘴出口处。整个系统的CAD模型、代码和组装指南均已开源发布在GitHub上。

3.2. LED计算模拟

通过ANSYS Speos软件进行的3D光强模拟显示，所采用的UV3TZ-405-15窄角LED能够输出精确的405 nm波长光。模拟结果与物理测量数据高度吻合，验证了计算模型的准确性。针对两种打印头附件的模拟（气动头LED夹角45°，温控头夹角30°）成功预测了在不同功率设置（30%、60%、100%）下，喷嘴处的平均空间光强，为实验提供了理论指导。

3.3. 水凝胶光交联表征

流变学测试表明，GelMA和PEGDA/Alginate两种生物墨水的交联动力学存在差异，PEGDA/Alginate的交联速率显著快于GelMA。随着光照强度（14, 30, 60, 90 mW/cm²）的增加，两种水凝胶的储能模量（G‘）增长速率和特定时间点的交联百分比均显著提高。这提示在实际打印中，可能需要根据材料特性调整光强，并且打印后补充交联（post-crosslinking）有助于达到理想的最终刚度，这对于调控细胞行为至关重要。

3.4. 使用ISX-Linker进行3D生物打印

打印实验直观地展示了ISX-Linker的效果。对于GelMA，未交联或低光强（30 mW/cm²）下打印的交叉网格结构扩散严重，形状模糊；而当光强增至60和90 mW/cm²时，网格孔隙清晰，形状保真度大幅提升。PEGDA/Alginate也表现出类似的趋势，其打印性指数（Pr）随着光强增加而显著改善。这表明原位光交联有效提升了低粘度水凝胶的打印精度。

细胞负载生物打印验证了系统的生物相容性：

研究人员将MSCs封装在GelMA中，使用ISX-Linker在不同光强下进行打印。力学测试显示，仅通过原位交联，单根纤维的杨氏模量随光强（30, 60, 90 mW/cm²）增加而阶梯式上升；进行打印后整体交联后，各组的刚度得到进一步提升，实现了对构建体力学性能的可调控。最关键的是，细胞活性检测结果显示，在所有实验组中（包括最高光强90 mW/cm²组），MSCs在打印后第1天均保持了高活性（>80%）。仅30 mW/cm²且未进行后交联的组细胞活性相对较低，研究者分析可能与交联不完全导致的结构刚度太低以及细胞可能泄漏有关。

结论与讨论部分强调了本研究的贡献与前景：

本研究成功开发并验证了一套开源的、可定制化的原位光交联系统（ISX-Linker），其意义在于直接对接了广泛使用的商业化生物打印平台（BioX?），显著降低了该技术的使用门槛。研究结果表明，ISX-Linker能够有效解决低粘度、温度依赖性光交联水凝胶（如GelMA和PEGDA/Alginate）在挤出打印中形状保真度差的瓶颈问题，且不依赖于添加流变改性剂。更重要的是，该系统在提升打印精度的同时，成功维持了封装细胞（MSCs）的高活性，并允许通过调整光强和结合后交联来调控水凝胶的最终力学性能，这对于模拟不同体内组织的微环境至关重要。

讨论中指出，与已有的需要特殊设备或采用整体光照的原位交联方法相比，ISX-Linker提供了更具普适性和可及性的解决方案。研究的开源性确保了其他研究者可以方便地获取、使用并根据需要修改该系统，例如更换不同波长的LED以适应其他光引发剂（如Irgacure 2959对应365 nm紫外光，或基于钌、曙红Y的可见光引发体系），或用于其他光固化材料和生物墨水。尽管本研究已展示了其在新材料拓展、光源自动控制与打印路径同步等方面的潜力，但未来工作仍可进一步优化，例如集成更智能的光强控制以匹配不同的打印速度和材料。总之，这项工作为组织工程和再生医学领域提供了一种强大的工具，有望推动更复杂、更精准、细胞活性更高的体外组织模型的生物制造。