洞穴细菌对碳酸钙的矿化作用

《Bioresource Technology》：Mineralization of calcium carbonate by cave bacteria

本研究调查了韩国济州岛永川洞火山管洞中碳酸钙沉淀微生物。通过15℃和25℃富集培养，从钟乳石滴液和生物膜样本中分离出12株细菌，其中Comamonadaceae科菌株在尿素培养基中去除85%溶解钙并形成方解石晶体。结果揭示了微生物通过pH变化（ureolytic途径）和生物膜矿化（non-ureolytic途径）驱动碳酸钙沉积的机制，为优化微生物生产碳酸钙提供依据。

　　

金由美|阿比吉特·曼纳|玛雅·克雷格|瑞奇·王-波伦多|尤尔·罗|姜成民|伊莱安娜·佩雷斯-罗德里格斯

美国宾夕法尼亚大学地球与环境科学系

摘要

本研究调查了来自韩国济州岛熔岩管永川洞的钟乳石滴样品和石笋生物膜样品中碳酸盐沉淀微生物的生长情况。在15°C和25°C条件下进行的微生物富集实验使用了针对尿素分解和非尿素分解生长的非选择性及选择性培养基，这些过程与碳酸盐生物矿化有关。共分离出12个属于假单胞菌科、杆菌科、莫拉克氏菌科和科马莫纳单胞菌科的菌株，并对这些菌株的碳酸钙（CaCO₃）生物矿化潜力进行了研究。通过分析微生物生长、培养基pH值变化及溶解钙含量的关系等指标，发现这些洞穴细菌能够驱动与微生物介导的CaCO₃沉淀一致的变化。在我们的实验中，科马莫纳单胞菌科中的一个菌株表现出最高的CaCO₃生成潜力，该菌株为草酸营养型，在含有尿素的培养基中可去除85%的溶解钙，并同时形成结晶方解石。基于这些结果，我们推测这些洞穴菌株通过微生物驱动的pH值变化产生方解石，并通过生物膜材料中的矿物成核作用生成文石。这些发现为了解韩国熔岩管中洞穴沉积物的形成相关的微生物和生物矿化机制提供了宝贵的见解，同时也为纯培养物和生物合成群落中微生物生产CaCO₃的优化策略提供了参考。

引言

微生物诱导的碳酸钙沉淀（MICP）是指微生物活动促进周围环境中碳酸根离子（CO₃^2–）和钙离子（Ca²⁺）反应从而自然产生CaCO₃的过程（Hemayati等人，2023年）。这一现象已在海洋环境中的叠层石和海滩岩石（Vincent等人，2020年）、喀斯特洞穴系统中的洞穴沉积物（Kurdy等人，2023年；Rusznyák等人，2012年；Braissant等人，2003年）以及与草酸产生植物相关的土壤中观察到（Verrecchia等人，2006年；Sun等人，2019年）。虽然微生物诱导的CaCO₃沉淀可以通过多种途径实现——包括尿素水解（Stocks-Fischer等人，1999年）；反硝化作用产生的碱度增加（Gao等人，2022年）；草酸营养作用（Sun等人，2019年）；碳酸酐酶催化的矿化作用（Li等人，2013年）；以及微生物生物量表面的矿物成核作用（Braissant等人，2003年）——但大多数MICP过程依赖于环境pH值的变化。尿素（CO(NH₂)₂的水解是最被广泛研究的MICP机制，它能将pH值从中性升高至9以上（Gat等人，2014年）。尿素分解细菌通过尿素酶的水解产生氨（NH₃）和碳酸（H₂CO₃）（方程式1的第1和2步），随后NH₃和H₂CO₃的平衡导致铵离子（NH₄⁺）、氢氧根离子（OH^?）和碳酸氢根离子（HCO₃^?的生成（方程式1的第3至5步）（Stocks-Fischer等人，1999年；Mitchell等人，2019年），从而引起pH值上升和碳酸氢根平衡的改变。当溶解的无机碳在pH值为8时开始分解为CO₃^2–时，它比以H₂CO₃和HCO₃^?的形式更容易沉淀（Maulas等人，2024年）。在存在Ca²⁺且pH值较高的情况下，CO₃^2–会以CaCO₃的形式沉淀（Phillips等人，2013年）。

非尿素分解的MICP过程也可以通过细菌氧化草酸或草酸钙（通过方程式2使pH值升高至9），以及通过反硝化作用产生的碱度增加、碳酸酐酶催化的矿化作用和/或某些需氧有机钙矿化过程来驱动pH值上升和CaCO₃的沉淀（Verrecchia等人，2006年；Bravo等人，2015年；Sun等人，2019年；Gao等人，2022年；Li等人，2013年；Hemayati等人，2023年）。

其他非尿素分解的MICP过程与细菌通过化能异养生长合成的功能化细胞壁或细胞外聚合物物质（EPS）有关，这些物质为Ca²⁺的吸附和矿物沉淀提供了最佳的晶体成核位点（方程式3的第8和9步）（Stocks-Fischer等人，1999年；Braissant等人，2003年；Hemayati等人，2023年；Zhu和Dittrich，2016年）。

在这项研究中，我们考察了韩国济州岛熔岩洞内与碳酸盐洞穴沉积物相关的细菌的MICP潜力。这些碳酸盐沉积物主要被认为是由土壤腐殖酸与上方石灰质沙丘中的钙通过非生物过程形成的（Woo等人，2008年；2019年）。然而，最近的研究开始关注微生物在这些洞穴沉积物形成中的作用（Kim等人，2025年）。我们的研究结果突出了洞穴细菌中尿素分解和非尿素分解MICP过程的潜力。

现场地点和采样程序

韩国济州岛的永川洞是一个典型的熔岩管洞穴，由晚第四纪时期的多次熔岩流形成（见Kim等人，2025年的图6）。其形态和内部微地形特征与世界各地的许多熔岩管相似（Woo等人，2008年），但该洞穴以石灰沉积物和发育良好的碳酸盐洞穴沉积物为特色——包括爆米花状和吸管状洞穴沉积物、钟乳石和石笋（Woo等人）。

非尿素分解细菌的分离

使用不含尿素的D-1培养基进行微生物分离后，从15°C条件下建立的洞穴生物膜样品中分离出2个菌株（1和2），从15°C或25°C条件下建立的洞穴水样品中分离出3个菌株（3、7和9）（表S1）。所有在固体培养基上生长的菌株都形成了亮黄色的菌落，除了菌株7，它形成了亮橙色的菌落（表S1）。当在液体培养基中生长时，所有菌株在5天内都产生了白色沉淀物并使培养基浑浊度增加。

来自永川洞的细菌菌株

我们分离出的12个菌株中有5个属于假单胞菌属（属于假单胞菌科），这一属之前已被发现是永川洞不同地点微生物富集样本中最丰富的菌群之一（Kim等人，2025年）。所有鉴定出的物种（图1）也曾在其他类似洞穴环境中被分离出来。例如，在西新几内亚的一个原始喀斯特洞穴壁上曾分离出P. fluorescens（Turrini等人）。

结论

来自永川洞的5个代表性菌株中有4个表现出与MICP过程相关的强烈活性。对于Variovorax菌株11，这种活性表现为溶解的NH₄⁺和pH值的增加，这与尿素存在条件下溶解的Ca²⁺的沉淀及方解石的生成有关。这些现象强烈表明尿素分解作用促进了NH₃和HCO₃^–的生成。

CRediT作者贡献声明

金由美：撰写——初稿、方法学、研究、概念构思。阿比吉特·曼纳：撰写——审稿与编辑、方法学、研究。玛雅·克雷格：研究。瑞奇·王-波伦多：研究。尤尔·罗：监督、资源协调、概念构思。姜成民：研究。伊莱安娜·佩雷斯-罗德里格斯：撰写——审稿与编辑、监督、资源协调、方法学、概念构思。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文研究结果的财务利益或个人关系。

致谢

本研究得到了宾夕法尼亚大学（Penn）授予I.P.-R.的启动资金，以及韩国国家研究基金会（NRF）授予Y.K.的NRF-2022R1C1C2009540和NRF-2022R1A2C1005449项目的资助。此外，宾夕法尼亚大学的Vagelos综合能源研究计划（VIPER）也为R.W.-P.提供了支持，宾夕法尼亚大学地球与环境科学系的Hayden学者夏季研究计划也为M.K.提供了支持。我们还要感谢...