《Biosensors and Bioelectronics》：Rational engineering of a large stokes shift fluorogenic sensor for sensing Notum in living systems and inhibitor screening
编辑推荐：
荧光传感器开发与hNotum抑制剂的发现及其在结直肠癌治疗中的应用。
李晓东|孙梦茹|苗家倩|胡聪|赵蓓|褚霞燕|吴继聪|郭兆斌|于春阳|金强|邹立伟|葛光波
中国上海中医药大学跨学科整合医学研究所中医药化学生物学上海前沿科学中心，国家重点实验室——传统中药功能成分发现与利用，上海，201203
摘要
Notum是一种丝氨酸水解酶，能够负调控Wnt/β-连环蛋白信号通路，并与包括结直肠癌（CRC）在内的多种疾病相关。本文报道了一种可通过酶激活的荧光传感器，用于动态监测和多维度成像人类Notum（hNotum）在复杂生物系统中的活性。通过反复优化半花青素报告基因和酶识别基序，我们确定了Oc-HNBI作为最佳的hNotum底物。Oc-HNBI具有高选择性、强结合亲和力、快速响应、较大的斯托克斯位移（142 nm）以及高量子产率，从而提供了出色的空间分辨率和成像性能。该荧光传感器已成功应用于多种生物环境中的hNotum活性原位成像，包括3D细胞球体、癌组织切片、器官组织以及活体小鼠模型。此外，Oc-HNBI还被用于开发高通量筛选方法以发现hNotum抑制剂。利用这种方法，我们发现天然化合物Sennoside A是一种有效的hNotum抑制剂，具有潜在的抗CRC作用。总体而言，本研究提供了一种可靠的荧光工具，用于检测和成像活体系统中的hNotum活性。这一工具有助于进一步理解hNotum在人类疾病中的作用，并为抗CRC药物发现做出贡献。
引言
Wnt/β-连环蛋白信号通路在哺乳动物中高度保守，对调节细胞命运、分化和组织修复与再生起着关键作用（Amir等人，2024；Janda等人，2017；Rharass等人，2017）。最新研究表明，Wnt信号通路的异常调控与多种癌症和炎症性疾病密切相关（Carson和Nejak-Bowen，2025；Jun等人，2016；Tewari等人，2021）。其中，hNotum被确认为Wnt信号通路的关键调节因子。hNotum的异常表达和活性直接导致Wnt/β-连环蛋白信号通路的异常激活（Bayle等人，2021；Pascual-Carreras等人，2023）。因此，hNotum被视为治疗Wnt相关疾病的关键靶点（Kakugawa等人，2015；Steadman等人，2022）。特别是在结直肠癌（CRC）中，大多数肿瘤存在APC基因的功能丧失突变，导致Wnt信号通路失调。hNotum是一种分泌型Wnt脱酰酶，通过去除Wnt信号传导所需的脂质修饰来调节细胞外Wnt活性。在Apc突变背景下，hNotum通过将Wnt信号调节至“恰到好处”的水平促进肿瘤发生，从而促进Apc突变癌干细胞的克隆扩增（Flanagan等人，2021；Kakugawa等人，2015；van Driel等人，2023）。因此，开发准确评估复杂生物系统中hNotum活性的方法对于理解异常hNotum-Wnt通路与疾病发生和发展之间的关系至关重要。这类方法在诊断和治疗应用中也具有巨大潜力。
荧光成像技术能够以高时空分辨率同时监测酶的活性，已应用于活体系统中酶功能的实时评估以及非侵入性疾病诊断（Dong等人，2025；Fu等人，2025；Li等人，2025；Liu等人，2025；Sun等人，2025；Wang等人，2021a）。作为计算机断层扫描（CT）和磁共振成像（MRI）等传统成像技术的补充，传感器技术彻底改变了体内酶成像，实现了酶活性的实时检测，促进了相关疾病的诊断和治疗（Wu等人，2022）。因此，开发能够实时监测和可视化hNotum活性动态变化的传感器工具至关重要。尽管已有几种hNotum传感器报道，但它们的应用受到短发射波长、低分辨率和稳定性差的限制（Atkinson等人，2023；Sun等人，2023）。因此，迫切需要设计一种新型多功能hNotum传感器。半花青素荧光团由于其独特的分子结构和光物理性质，在生物成像和化学传感方面具有显著优势（Liu等人，2021；Zeng等人，2021）。这些荧光团通常具有高光稳定性（Gunduz等人，2021；Wang等人，2021b），在长时间成像过程中保持信号强度并减少光漂白现象，同时具有高荧光量子产率和高的摩尔消光系数（Huang等人，2021；Luo等人，2022；Muhammad等人，2025），即使在低浓度下也能提供清晰的成像信号。此外，半花青素荧光团通常具有较大的斯托克斯位移，有助于减少多重成像中的信号重叠。它们还具有低生物毒性，非常适合活细胞和活体成像（Dahal等人，2019；Li等人，2024；Sun等人，2016）。此外，合成半花青素荧光团所需的原材料价格低廉且易于获取，合成方法相对简单，便于大规模生产（Li等人，2022；Sun等人，2016）。
基于这些考虑，设计并合成了八种具有不同结构类型的半花青素荧光报告基因（方案1和表S1）。其中，HNBI因具有较大的斯托克斯位移和高荧光量子产率而被选为hNotum传感器的荧光报告基因（图S1）。此外，根据hNotum的催化腔特性和底物偏好，设计并合成了九种具有不同酯链长度和侧链修饰的候选传感器（方案1和表S1）。最终，Oc-HNBI被证实是一种新型hNotum传感器，表现出快速响应、高选择性和多功能成像能力。利用Oc-HNBI的优秀光学特性和亚型特异性，随后筛选了多种天然产物，包括生物碱和查尔酮。结果发现Sennoside A是一种新型且有效的hNotum抑制剂，在体内显示出优异的抗结直肠癌效果和生物安全性。这一发现显著提升了hNotum作为治疗靶点的潜力，并突显了其在药物开发中的重要性。
hNotum传感器的设计与合成
设计一种新型、高特异性的hNotum荧光传感器，以实现快速响应和多功能成像仍是一个重大挑战。为了确定最佳的半花青素荧光团骨架，设计并合成了八种半花青素荧光团（HNPI、HNBI、HNFI、HNKI、HNAI、HBBO、BHFH和BIFI）（图1A）。根据它们的吸收/发射光谱、斯托克斯位移和荧光量子产率（表S1），HNBI显示出最高的成像潜力（最大的斯托克斯位移）
结论
总结来说，先前的研究报道了可用于功能成像和抑制剂筛选的hNotum激活型荧光传感器（例如MOF），而OPTS主要用作体外活性测定的商业生化底物。这些进展强调了需要具有改进光学性能和减少复杂生物样本中基质干扰的成像导向传感器。基于这一理念，我们开发了一种基于半花青素的荧光传感器，用于实时
实验程序
半花青素荧光报告基因和HNBI衍生物的设计、合成和表征详细信息见补充材料。
利益冲突声明
作者声明没有利益冲突。
CRediT作者贡献声明
金强：撰写 – 审稿与编辑，监督，资金获取。
于春阳：软件，方法学。
李晓东：撰写 – 原稿撰写，验证，方法学，实验研究。
葛光波：撰写 – 审稿与编辑，监督，资金获取，概念构思。
邹立伟：撰写 – 原稿撰写，监督，概念构思。
苗家倩：可视化，方法学，数据管理。
孙梦茹：方法学，实验研究，数据管理。
赵蓓：实验研究，形式化处理。
未引用的参考文献
Jun等人，2016年。
