利用糖基化工程改造的本氏烟草平台生产具有交叉中和活性的人源化抗登革病毒NS1单克隆抗体D8

《Biotechnology Reports》：Development of anti-dengue virus D8 neutralizing monoclonal antibody production in Nicotiana benthamiana

本研究旨在解决登革热疗法中存在的抗体依赖性增强（ADE）风险及生产成本高昂问题。研究人员在本氏烟草ΔXF植物中成功表达并纯化了抗登革病毒NS1的单克隆抗体D8，并通过LC-MS、FRNT50和ELISA等技术评估其功能。结果表明，植物源D8抗体具备哺乳动物样糖基化谱，对全部四种登革病毒血清型（DENV1-4）均显示出强效的交叉中和活性，其中对DENV4的活性最强（FRNT50< 1 μg/mL），并显著结合各血清型NS1蛋白。这为在资源有限地区开发安全、可负担的抗登革热治疗性抗体提供了概念验证。

　　

登革热，这种由蚊子传播的病毒性疾病，每年在全球热带和亚热带地区造成数亿人感染，其中近亿人出现临床症状，从轻微的登革热到可能致命的登革出血热和登革休克综合征。尽管疫苗研发已持续数十年，但由于四种不同血清型（DENV1-4）的病毒共同流行，以及“抗体依赖性增强（ADE）”这一棘手风险的存在，有效疫苗的开发仍面临巨大挑战。ADE是指，当一个人感染过一种血清型登革病毒后产生的抗体，不仅不能有效中和另一种血清型病毒，反而会像“特洛伊木马”一样，帮助病毒进入带有Fcγ受体的细胞，导致二次感染时病情更重。目前已有的疫苗如CYD-TDV和TAK-003，在保护效力和适用人群上仍有局限。与此同时，针对登革病毒的特效抗病毒药物也尚未问世。

在这一背景下，治疗性抗体作为一种替代干预策略受到越来越多的关注。特别是靶向病毒非结构蛋白1（NS1）的抗体，展现出独特的优势。与靶向病毒包膜（E）蛋白、可能引发ADE的抗体不同，抗NS1抗体主要通过抗体依赖性细胞毒性（ADCC）、抗体依赖性细胞吞噬作用（ADCP）等Fc介导的效应机制发挥作用，能够清除受感染细胞，并减轻NS1蛋白本身引起的血管渗漏等致病效应。此前，研究人员从登革热患者体内分离并鉴定出一株具有潜力的单克隆抗体——D8，它具有双重特异性，既能结合E蛋白直接中和病毒，又能结合NS1蛋白减轻病理损伤。然而，传统的哺乳动物细胞（如CHO细胞）生产抗体成本高昂、工艺复杂，限制了其在登革热流行的中低收入国家的可及性。

为了开发一种更经济、可及的抗体生产平台，一个研究团队将目光投向了植物表达系统。他们选择在一种经过糖基化工程改造的本氏烟草（Nicotiana benthamiana ΔXF）中，重新表达并生产这种抗登革病毒D8单克隆抗体。他们的研究成果发表在《Biotechnology Reports》上，旨在验证植物平台能否生产出结构正确、功能完备的D8抗体，并评估其作为登革热治疗候选药物的潜力。

研究中应用的关键技术方法：

本研究采用了一系列关键技术以达成研究目标。首先，利用农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）介导的瞬时转化技术，将含有D8抗体重链和轻链基因的载体导入本氏烟草ΔXF植株中进行表达。该植物株系经过基因改造，沉默了两类糖基转移酶基因，能够生产缺乏植物特异性木糖和核心岩藻糖残基、更接近哺乳动物样式的N-聚糖。抗体从叶片中提取后，通过蛋白A亲和层析法进行纯化。随后，使用SDS-PAGE和Western blotting验证了抗体的完整性和组装。通过液相色谱-质谱联用（LC-MS）进行了亚基质量分析和肽图分析，以确认蛋白分子量、氨基酸序列覆盖度和糖基化修饰状态。抗体的功能评估主要包括：使用聚焦减少中和试验（Focus Reduction Neutralization Test， FRNT）测定其对四种登革病毒血清型（DENV1-4）的交叉中和活性，并用酶联免疫吸附测定（ELISA）检测其与各血清型重组NS1蛋白的结合能力。

研究结果

3.1. 植物生产的D8单克隆抗体的表达与纯化

通过农杆菌浸润法在本氏烟草中表达了D8抗体，并从叶片中纯化得到产物。SDS-PAGE和Western blotting分析显示，在非还原条件下，纯化产物在约150 kDa处有一条主带，对应完整的IgG分子；在还原条件下，则可观察到约50 kDa的重链和约25 kDa的轻链条带，证实植物源D8抗体被正确表达和组装。

3.2. N-糖基化分析

LC-MS亚基质量分析显示，轻链亚基分子量为23，562 Da，与理论值一致；重链亚基则显示出非糖基化形式（50,050.6 Da）和多种糖基化形式（如51,223.5 Da）的混合峰，表明重链发生了部分糖基化。进一步的肽图分析显示，在Asn308位点，大部分（73.5%）的D8抗体分子是非糖基化的，而糖基化的部分（26.5%）主要携带植物型寡甘露糖型聚糖，如GnM3（13.3%）和GnGn（7.4%），且缺乏植物特有的β1，2-木糖和核心α1，3-岩藻糖残基，呈现哺乳动物样的糖基化谱。

3.3. 植物源D8 mAb和HuMAb克隆8对DENV的交叉中和活性

FRNT实验结果表明，植物源D8抗体对全部四种登革病毒血清型均表现出强效且广泛的交叉中和活性，其效力与在HEK（人胚胎肾）细胞中生产的HuMAb克隆8相当。具体而言，植物源D8对DENV4的中和能力最强（FRNT₅₀为0.78 μg/mL），其次是对DENV2（5.82 μg/mL）、DENV3（9.49 μg/mL）和DENV1（28.68 μg/mL）。这证实了植物表达系统能够生产出功能完备的、具有广谱中和活性的抗体。

3.4. 与NS1蛋白的结合

ELISA实验证实，无论是HEK细胞源还是植物源的D8抗体，均能与所有四种血清型（DENV1-4）的NS1蛋白发生交叉结合，并且都对DENV2的NS1显示出最强的结合信号。值得注意的是，植物源D8抗体在所有血清型上的结合信号（OD₄₅₀值）均显著高于HEK细胞源的抗体，例如对DENV2 NS1的结合信号（OD₄₅₀～ 1.7）远高于后者（OD₄₅₀～ 0.15）。尽管结合力存在差异，但两者的中和活性却相近，表明ELISA的结合信号强度并不完全等同于其功能性中和效力。

研究结论与讨论

本研究成功在糖基化工程改造的本氏烟草ΔXF植物中表达了抗登革病毒NS1的单克隆抗体D8，并对其进行了全面的生化和功能表征。核心结论是：植物生产的D8抗体保留了其双重特异性（既能靶向E蛋白，也能靶向NS1蛋白），并展现出与哺乳动物细胞生产版本相当的、针对所有四种登革病毒血清型的强效交叉中和活性。这种双重作用机制意味着它既能通过结合E蛋白直接阻断病毒入侵，又能通过中和分泌型的NS1蛋白来减轻病毒引起的血管病理损伤。

讨论部分进一步阐明了本研究的意义和潜在影响。首先，研究强调了NS1作为一个治疗靶点的优势，因其介导的致病机制与ADE风险相对独立。D8抗体对DENV2 NS1表现出显著的结合偏好，这可能源于其最初是从DENV2感染患者体内分离的，也反映了不同血清型NS1蛋白在表位呈现上的结构差异。其次，研究重点分析了糖基化工程的价值。所使用的ΔXF植物系统去除了植物特有的木糖和岩藻糖残基，产生了以GnGn和GnM3为主的、更接近哺乳动物的糖基化谱。以往研究表明，这种均质化的、缺乏核心岩藻糖的聚糖结构可以增强抗体依赖性细胞毒性（ADCC）活性，并可能降低ADE风险。然而，作者也谨慎指出，高水平的非岩藻糖基化IgG₁抗体虽然能强力激活FcγRIIIa，但在登革热感染背景下也可能与更严重的疾病（如血小板减少症）相关。因此，未来需要在体内模型中进一步评估植物源D8抗体的Fc介导的效应功能及其与ADE风险的平衡。

总而言之，这项研究提供了概念验证，表明经过糖基化优化的植物表达平台能够作为一种可行且具成本效益的生产系统，用于制造功能完备、具有交叉保护作用的治疗性单克隆抗体。这为在登革热流行且资源有限的地区开发新型、可负担的生物疗法开辟了一条有前景的路径。