《Cancer Genetics》：Specific Variations in cfDNA Methylation Level of
CDH1 and
Gjb1 in a Mouse Model with Breast Cancer Before and After Metastasis
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乳腺癌转移血清cfDNA甲基化研究：通过建立4T1高转移性BC小鼠模型，结合荧光成像监测淋巴结转移，发现CDH1和GJB1甲基化水平在转移前后的血清cfDNA中显著变化，与肿瘤组织甲基化趋势一致，为早期监测转移提供新生物标志物。
作者：卓张、杨书慧、詹行通、金卓、周新晨、张丽英、孙思琪、杨春、夏伟、刘丽梅
单位：北华大学医学技术学院实验中心，中国吉林省吉林市丰满区滨江东路3999号
摘要
乳腺癌（BC）的转移是治疗过程中的一个严重问题。早期诊断和及时干预对患者至关重要。已有研究表明，在乳腺癌发生过程中，循环游离DNA（cfDNA）的表观遗传修饰会发生变化，但在转移之前和之后则没有这种变化。因此，本研究旨在建立一个高度转移性的4T1乳腺癌小鼠模型，该模型与人类IV期乳腺癌高度相似，以探讨转移前后cfDNA甲基化修饰的变化。乳腺癌转移的时间点是根据小鼠腋窝淋巴结中首次可见荧光信号来确定的。研究结果表明，血清cfDNA中的CDH1和Gjb1的甲基化水平在转移前后发生了显著变化，其变化趋势与肿瘤组织DNA中的变化类似。cfDNA的甲基化水平可以作为乳腺癌早期诊断和监测的候选生物标志物。
引言
乳腺癌（BC）是一种起源于乳腺组织的恶性肿瘤。根据2022年GLOBOCAN癌症统计数据，乳腺癌的发病率（23.8%）和死亡率（15.4%）在所有女性恶性肿瘤中均位居首位[[1], [2]]。此外，其高死亡率与乳腺癌转移之间存在显著正相关[3]。在乳腺癌转移之前，会发生上皮-间质转化（EMT），在此过程中，上皮肿瘤细胞会转变为间质细胞，获得侵袭能力，从而扩散到淋巴结和远端器官（如肝脏和肺部），进而促进肿瘤转移并使治疗复杂化[[4], [5]]。作为肿瘤细胞转移的关键环节和中间过程[6]，乳腺癌的EMT通常是通过表观遗传修饰实现的，这些修饰赋予肿瘤细胞可遗传的表型变化，而不是通过引入新的突变[7]。这些基因表达的变化主要由DNA甲基化介导，而DNA甲基化是癌症中最常见的表观遗传修饰类型[8]。血清中的循环核酸是癌症研究中最受关注和应用最广泛的指标之一。在肿瘤发展过程中，DNA和RNA会释放到外周血液中，形成血清循环游离DNA（cfDNA），这可以准确反映肿瘤细胞的变化特征[9]，这些变化通常与肿瘤的进展阶段和位置变化密切相关[10]。持续监测转移性癌症患者的cfDNA有助于判断肿瘤进展、选择治疗方法并监测治疗反应[11]。因此，本研究建立了基于BALB/c小鼠4T1乳腺癌细胞的高度转移性乳腺癌模型，以探讨转移前后血清cfDNA的甲基化变化，旨在补充或替代传统的遗传学方法，用于乳腺癌转移的早期监测。
不同表达基因的筛选
从GEO数据库（
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）下载了GSE62817数据集，并分析了具有肺转移的4T1乳腺癌小鼠与无转移的67NR乳腺癌小鼠之间的基因表达差异。GSE62817使用GPL1261作为实验平台，包含了转移性（
n = 4）和非转移性（
n = 5）样本的基因表达谱数据。分析前，高通量数据进行了log2标准化处理。使用R语言中的limma包进行了进一步分析
转移性乳腺癌肺组织中S100A9的上调与Gjb1的下调
在GSE62817数据集中，共识别出122个在转移性和非转移性乳腺癌肺组织之间差异表达的基因（DEGs），其中78个基因在转移性乳腺癌中上调，44个基因下调（图1A和1B）。然后，通过与dbEMT 2.0数据库中下载的416个EMT基因数据集进行交集分析，筛选出9个上调基因和4个下调基因（图1C）。最终确定了上调基因S100A9和下调基因Gjb1。
讨论
乳腺癌是最常见的癌症之一，根据疾病进展可分为四个阶段。当乳腺癌进展到IV期时，通常会伴随淋巴结和远端器官（如肺、肝、骨和脑）的转移。总体预后较差，大多数患者无法治愈。这影响了患者的生存时间和生活质量[[15], [16]]。4T1乳腺癌模型是一种高度转移性的乳腺癌模型[17]，它在注射部位形成原发肿瘤...
结论
本研究建立了一个高度转移性的4T1乳腺癌小鼠模型，以模拟人类乳腺癌的发展和转移过程。通过慢病毒将GFP转染到4T1乳腺癌细胞中，并利用荧光和体内成像技术监测转移情况。使用RT-qPCR评估了各组织中的EMT状态，证实了EMT相关转移发生前的和发生后的时期。结果表明，在转移发生前1天，各种组织中已经出现了与EMT相关的变化...
资助
本研究得到了吉林省科技发展计划项目（项目编号：YDZJ202301ZYTS168）、吉林省人力资源和社会保障厅的创新与创业人才资助项目（项目编号：2023RY12）以及吉林省科学技术发展计划（项目编号：20240401078YY）的支持。
作者贡献
Z. Z. 进行实验、数据分析并撰写手稿；X. Z. 进行生物信息学分析；C.Y. 和 L.S. 协助动物实验；X. Z. 和 S. Y. 进行实验；Z. J. 和 L.Z. 分析数据；W. X. 构思项目；L. L. 审阅手稿。所有作者均阅读并批准了最终版本的手稿。
作者声明
我们声明本手稿为原创作品，此前未发表过，也未在其他地方接受发表审核。
我们确认所有署名作者均已阅读并批准了本手稿，且没有其他符合作者资格但未列入名单的人员。我们还确认手稿中作者的排序已得到所有作者的认可。
我们明白通讯作者是与编辑联系的唯一联系人。
作者贡献声明
卓张：撰写初稿、方法学设计、数据分析。
杨书慧：数据验证。
詹行通：数据验证。
金卓：数据验证。
周新晨：数据验证。
张丽英：数据验证。
孙思琪：数据验证。
杨春：方法学设计。
夏伟：项目管理、概念构思。
刘丽梅：撰写、审稿与编辑、监督、方法学设计、研究设计、概念构思。
