《Cancer Letters》：Cancer-associated fibroblasts promote immune evasion in pancreatic cancer via miR-181b-5p/STING/LGALS1 pathway
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胰腺癌免疫逃逸机制研究中发现CAFs分泌的miR-181b-5p通过靶向SEC24C抑制STING磷酸化，阻断YY1核转位，激活LGALS1/SUSD2通路促进CD8+ T细胞凋亡。
张少波|郭圆圆|齐浩然|吴梦瑶|胡玉萌|吕高远|叶宇欣|韩静|曾琼|杜跃然|徐炳和|刘明阳
中国医学科学院/北京协和医学院国家癌症中心/国家临床研究中心/分子肿瘤学国家重点实验室，北京，中国
摘要
胰腺癌仍然是最致命的恶性肿瘤之一，其特点是具有天然的“免疫荒漠”特性。尽管近年来癌症免疫疗法取得了显著进展，但在胰腺癌中的疗效仍然很低。癌相关成纤维细胞（CAFs）在胰腺癌的进展和免疫调节中起着关键作用。尽管它们的临床潜力受到了广泛关注，但其具体功能和潜在机制仍不明确。在这里，我们阐明了CAFs通过重新编程胰腺癌细胞（PC cells）来抑制CD8+ T细胞的机制。我们发现，CAFs在体外增强了PC细胞的CD8+ T细胞抑制功能，并且在体内通过减少和功能失调的CD8+ T细胞促进了肿瘤进展。机制上，CAFs产生的miR-181b-5p靶向PC细胞中的SEC24C（STING的关键转运蛋白），从而抑制STING的磷酸化。STING磷酸化的抑制阻断了YY1的核转位，进而解除了对SUSD2和LGALS1转录的抑制。上调的LGALS1随后通过SUSD2的帮助被分泌出来，最终抑制CD8+ T细胞的功能并诱导其凋亡。我们的发现定义了胰腺癌中的基质-免疫轴，将CAFs中的miR-181b-5p与肿瘤细胞中通过STING途径建立的免疫抑制微环境联系起来，揭示了这一级联反应作为对抗免疫逃逸的可靶向机制。
引言
预计到2030年，胰腺癌（PC）将成为美国癌症相关死亡的第二大原因(1)。其五年生存率低于13%(2)，主要是由于诊断延迟、早期转移以及对化疗和免疫治疗的显著抵抗(3)。在胰腺癌的特征中，通过免疫抑制性肿瘤微环境（TME）逃避免疫破坏的能力在推动疾病进展和不良临床结果方面起着关键作用(4, 5)。虽然免疫疗法已经改变了其他几种癌症类型的管理(6)，但其在胰腺癌中的临床益处仅限于少数患者(7, 8, 9)，主要是由于主导的免疫抑制机制限制了T细胞的浸润和功能(10)。因此，阐明这种免疫抑制的机制并确定重新激活抗肿瘤免疫的目标是当前研究的关键优先事项(11)。
胰腺癌的TME以明显的纤维化基质、广泛的细胞外基质（ECM）沉积以及富含癌相关成纤维细胞（CAFs）的复杂基质部分为特征(13, 14)，这些细胞不仅是结构成分，还是促进肿瘤进展、免疫逃逸和治疗抵抗的活跃因素(15)。CAFs在调控免疫抑制环境方面起着关键作用(16)。它们利用复杂的机制来强烈减弱抗肿瘤免疫反应并促进肿瘤的免疫逃逸(17, 18)。CAFs通过四种主要机制协同减弱抗肿瘤免疫：建立物理屏障、分泌免疫抑制因子、改变代谢途径以及招募抑制性免疫细胞(19)。例如，COL11A1
+ CAFs在肺癌的肿瘤-基质界面形成屏障，可能阻碍T细胞的浸润(20)；CAFs可以通过上调肿瘤细胞上的PD-L1表达来介导免疫逃逸(21)；NNMT
+ CAFs分泌大量的补体因子以招募髓系来源的抑制细胞（MDSCs），进一步抑制细胞毒性CD8
+ T细胞的活性(22)。因此，进一步研究CAFs与肿瘤细胞之间的具体相互作用以调节免疫逃逸可能为克服胰腺癌免疫治疗的挑战提供新的策略(23, 24)。
外泌体是大小在30–150纳米之间的小囊泡，可以包裹多种分子，包括核酸、蛋白质和代谢物(25, 26)。许多研究表明，CAFs通过分泌外泌体将物质和信号传递给肿瘤细胞，从而提供必要的物质或重新编程肿瘤细胞以促进恶性表型(27, 28, 29, 30)。微小RNA（miRNAs）作为外泌体 cargo 的关键组成部分，在细胞增殖(30)、分化(31)、凋亡(32)和免疫调节(33, 34)等各种生物过程中起着关键的转录后调节作用。基于miRNAs的诊断方法在临床应用中具有巨大潜力(35, 36, 37, 38, 39, 40)。例如，研究显示，CAFs产生的miR-146a-5p可以创造一个增强膀胱癌干性和化疗抵抗性的微环境(41)；CAFs产生的外泌体miR-17-5p通过启动RUNX3/MYC/TGF-β1正反馈循环促进结直肠癌的侵袭性表型(42)；CD63
+ CAFs通过外泌体miR-20赋予乳腺癌细胞CDK4/6抑制剂的抵抗性(43)。尽管已知CAFs产生的miRNAs在促进肿瘤增殖、化疗抵抗性和代谢重编程方面发挥作用，但它们如何促进肿瘤免疫逃逸尚不明确(44)。基于miRNAs的稳定性和生物标志物效用，识别与免疫逃逸相关的新miRNAs并阐明其功能机制对于开发靶向疗法和早期非侵入性诊断方法至关重要(45, 46, 47, 48)。
在这项研究中，我们发现来自CAFs的外泌体miR-181b-5p在胰腺癌细胞中抑制STING通路，从而通过增强肿瘤细胞抑制CD8+ T细胞的能力来促进免疫逃逸。机制上，miR-181b-5p靶向SEC24C（编码STING转运蛋白）的3'UTR，导致SEC24C表达减少和STING磷酸化受损。结果，转录因子YY1的核转位被阻断，从而解除其对下游靶基因LGALS1和SUSD2的抑制，使其转录激活。LGALS1/SUSD2复合物介导LGALS1的分泌。分泌的LGALS1随后与CD8+ T细胞上的受体结合，从而抑制其招募，减弱其活性并诱导其凋亡。这项研究描绘了一种由CAFs介导的新的免疫逃逸途径。恢复这一途径可以与现有的免疫疗法协同作用，以克服耐药性并改善患者预后。
实验部分
细胞培养
AsPC-1细胞购自美国典型培养集（ATCC）。KPC细胞来源于KRASG12D TP53R172H PDX-1-CRE+/+（KPC）小鼠。AsPC-1细胞在含有10% FBS和1% 青霉素-链霉素的RPMI1640培养基中培养。KPC细胞在含有10% FBS和1% 青霉素-链霉素的DMEM培养基中培养。
原代成纤维细胞的分离
人类CAFs是从患有PDAC的患者的手术切除的胰腺肿瘤组织中分离出来的。新鲜肿瘤组织用磷酸盐缓冲盐水洗涤以去除...
CAFs在体外使PC细胞抑制CD8+ T细胞功能
为了研究CAFs在TME中抑制CD8+ T细胞的机制，我们从胰腺癌患者的新鲜肿瘤组织中分离出原代人类CAFs，分别命名为hCAF1、hCAF2和hCAF3，并设计并进行了涉及CAFs、PC细胞和CD8+ T细胞的共培养实验（图1A）。我们发现，单独的PC细胞或CAFs都不能显著抑制CD8+ T细胞，但PC细胞和CAFs的组合显著抑制了CD8+ T细胞中的IFN-γ表达（图1B）。随后，当...
讨论
免疫抑制性TME在推动免疫逃逸和胰腺癌进展中起着关键作用(60)。在基质成分中，CAFs在塑造这种免疫敌对微环境中特别具有影响力(61)。尽管CAFs的功能多样性已被认可(62)，但它们如何具体调控T细胞抑制和赋予免疫治疗抵抗性仍不清楚，这阻碍了治疗的进展。解决这一知识空白对于开发重新激活抗肿瘤免疫的策略至关重要
作者贡献声明
张少波：撰写——原始草案，研究。
刘明阳：撰写——审阅与编辑，项目管理，资金获取，概念构思。
郭圆圆：验证，研究，数据管理。
徐炳和：撰写——审阅与编辑，项目管理，资金获取，概念构思。
胡玉萌：验证，研究，数据管理。
吴梦瑶：验证，研究，数据管理。
韩静：研究。
资金来源
本研究得到了国家自然科学基金（编号：82541004、82273452和92474301，资助给M.Liu）、北京自然科学基金（编号：JQ25026，资助给M.Liu）、中国科学院医学科学创新基金（编号：2023-I2M-2-004，资助给M.Liu）、中国科学院非营利性中央研究院基金（编号：2022-RC310-01，资助给M.Liu）以及非传染性疾病-国家科技重大专项（编号：...）的支持。
