《Cancer Letters》：Pharmacological inhibition of histone deacetylase 6 and DNA damage repair enhances radiosensitivity in melanoma
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本研究通过高通量筛选发现HDAC6抑制剂WT-161能增强放疗对黑色素瘤的疗效，机制为抑制HDAC6破坏DNA修复蛋白相互作用，导致DNA损伤累积，最终抑制肿瘤生长。
傅一典|姜朝阳|陈颖|李芳|何晓宇|马亮|谢书尔|叶琳|葛胜芳|于杰|杨志|范先群
上海交通大学医学院附属第九人民医院眼科，眼健康国家重点实验室，上海200025，中国
摘要
黑色素瘤是一种起源于产生黑色素的黑色素细胞的恶性肿瘤，对人类健康构成重大威胁，包括皮肤黑色素瘤和葡萄膜黑色素瘤（UM）。尽管手术切除仍是主要的治疗手段，但放射治疗已成为另一种治疗选择，尤其是对于葡萄膜黑色素瘤。然而，放射治疗引起的不良反应相当明显。在本研究中，我们通过高通量药物筛选发现WT-161（一种选择性的组蛋白去乙酰化酶6（HDAC6）抑制剂）具有显著的放射增敏作用。其机制在于抑制HDAC6与DNA损伤修复蛋白（DDB2和DEK）的相互作用，并抑制DNA损伤修复途径中的基因表达，从而导致辐射诱导的DNA损伤积累和肿瘤消退。我们的发现确立了HDAC6作为黑色素瘤放射反应预测生物标志物的潜力，并表明使用WT-161药理学抑制HDAC6可以扩大放射治疗在葡萄膜黑色素瘤患者中的临床应用。
引言
黑色素瘤是一种起源于黑色素细胞的侵袭性恶性肿瘤，这些细胞主要位于皮肤中，但也存在于眼睛、耳朵、软脑膜和胃肠道等体外部位[1]。葡萄膜黑色素瘤（UM）是一种特殊的亚型，起源于葡萄膜内的黑色素细胞，其中90%的病例发生在脉络膜，6%发生在睫状体，4%发生在虹膜[2]。虽然手术切除仍是黑色素瘤治疗的基石，但在特定临床情况下，放射治疗（RT）已成为重要的治疗手段[1][3]。例如，辅助放射治疗显著提高了高风险患者术后局部肿瘤的控制率，降低了复发的可能性[4]。值得注意的是，在葡萄膜黑色素瘤的治疗中，放射治疗发挥着不可或缺的作用，传统的眼球摘除术正逐渐被保留视力的方法所取代。对于中小型葡萄膜黑色素瘤，放射治疗是首选治疗方法[5]。目前，超过90%的保留眼球的患者接受了某种形式的放射治疗——最常见的是巩膜外近距离放射治疗，其他方法还包括带电粒子照射、立体定向放射治疗或放射外科手术[3]。然而，需要使用极高的辐射剂量进行治疗，这常常会导致眼部并发症，如白内障、视网膜病变、视乳头病变和新生血管性青光眼[6]。因此，开发放射增敏剂旨在以较低的辐射剂量实现相同的治疗效果，从而减轻不良反应。
正在进行的研究继续探索新的放射增敏靶点并开发放射增敏剂以提高放射治疗的效果。放射治疗主要通过DNA损伤发挥其细胞毒性作用，触发DNA修复机制来修复或耐受这种损伤。DNA修复能力主要由修复基因的表达水平决定，而这些基因受到表观遗传调控[7]。近年来，表观遗传机制在肿瘤治疗靶点和治疗抵抗性方面受到了越来越多的关注[8][9]。几种表观遗传药物已被证明在多种恶性肿瘤中具有放射增敏作用。例如，组蛋白去乙酰化酶（HDAC）抑制剂已被证明能增强胶质母细胞瘤[10]、前列腺癌[11]和非小细胞肺癌（NSCLC）[12]的放射治疗效果。此外，DNA甲基化（另一种关键的表观遗传修饰）也被认为会影响细胞对辐射的反应[8]。
HDAC6是一种主要位于细胞质中的IIB类组蛋白去乙酰化酶，通过去乙酰化多种底物执行多种生物功能[13]。与其他HDAC家族成员不同，HDAC6独特地同时靶向组蛋白和非组蛋白，包括α-微管蛋白、皮质actin和热休克蛋白90（HSP90），从而调节细胞增殖、转移、侵袭和有丝分裂等关键致癌过程[14]。在过去十年中，HDAC6已被认为是细胞对细胞毒性损伤反应的关键调节因子。其在多种恶性肿瘤中的致癌作用已有充分记录，包括乳腺癌[15][16][17]、甲状腺肿瘤[18]、结肠直肠癌[20]、肝癌[21][22]和B细胞淋巴瘤[23][24]。值得注意的是，HDAC6与化疗耐药性（如胶质母细胞瘤[25]和肺腺癌[25]）以及放射耐药性（如胶质母细胞瘤[26][27]、脑膜瘤[28]、头颈部癌症[29]和膀胱癌[30]）有关。目前，HDAC6的小分子抑制剂正在针对骨髓瘤[31]和淋巴系统恶性肿瘤[15]进行晚期临床试验。新兴证据表明，全身给药HDAC6抑制剂可以通过重塑肿瘤免疫微环境来增强抗CD47和抗PD-1疗法在黑色素瘤中的抗肿瘤效果[32][33]。然而，HDAC6在黑色素瘤放射反应中的潜在作用仍不清楚。
在这项研究中，我们筛选了一个表观遗传药物库，以寻找能够增强黑色素瘤对放射治疗敏感性的化合物。通过筛选，我们发现了WT-161（一种特定的HDAC6抑制剂[34][35]），它是一种有效的黑色素瘤放射增敏剂。我们的结果表明，药理学抑制HDAC6显著增强了体外和体内黑色素瘤模型中放射治疗的效果。放射治疗与HDAC6抑制的联合治疗有效抑制了细胞活力和肿瘤生长，再现了HDAC6基因敲低观察到的表型效应。机制上，我们发现HDAC6与DNA修复蛋白DDB2和DEK相互作用。抑制HDAC6破坏了这种相互作用，损害了细胞的DNA损伤反应途径，从而导致辐射诱导的DNA损伤持续积累，并最终促进肿瘤细胞死亡。这些发现确立了将HDAC6抑制剂WT-161与放射治疗结合用于黑色素瘤治疗的潜力，为患者提供了一种新的、更安全的策略。
细胞系和细胞培养
人类葡萄膜黑色素瘤细胞系OMM2.3由荷兰莱顿大学医学中心的Martine J. Jager教授提供。皮肤黑色素瘤细胞系A375购自美国弗吉尼亚州马纳萨斯的美国典型培养物收藏中心（American Type Culture Collection）。OMM2.3细胞的培养基为RPMI-1640（Gibco）。A375细胞在DMEM（Gibco）中培养。所有培养基均添加了10%的胎牛血清（FBS，Gibco）和1%的青霉素/链霉素（NCM）。
通过表观遗传药物筛选鉴定HDAC6抑制剂作为放射增敏剂
为了增强黑色素瘤的放射反应[38]，我们对311种针对组蛋白乙酰化、组蛋白甲基化和DNA甲基化途径的表观遗传化合物进行了全面筛选（表S1），这些化合物用于皮肤（A375）和葡萄膜（OMM2.3）黑色素瘤细胞系。细胞单独或与放射治疗联合使用这些化合物进行处理（图1A）。我们的高通量筛选发现WT-161（一种选择性的HDAC6抑制剂）是十大协同效应最强的化合物之一。
讨论
黑色素瘤的侵袭性生长和转移倾向使其成为全球范围内的重大公共卫生问题[54]。放射治疗逐渐成为主要的治疗手段，特别是在患有黑色素瘤脑转移和葡萄膜黑色素瘤的患者中。然而，放射治疗的效果常常受到剂量限制和不良反应的影响[3]。本研究表明，抑制HDAC6是一种有前景的策略，可以增强放射治疗效果。
作者贡献声明
杨志：写作——审稿与编辑、验证、资金获取。
傅一典：写作——审稿与编辑、初稿撰写、方法学设计、实验研究、数据分析。
葛胜芳：监督、资金获取。
于杰：实验研究、资金获取、概念构思。
谢书尔：软件使用、数据分析。
叶琳：验证、资金获取。
何晓宇：验证、监督。
马亮：验证、软件使用。
陈颖：方法学设计、数据分析。
李芳：项目统筹。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的财务利益或个人关系。
致谢
本研究得到了中国国家基础科学中心（82388101）、国家自然科学基金（82200961、8220326、12405389、12505410、12275178）、上海市科学技术委员会（20DZ2270800、22YS1400400和24YF2723800）、中国博士后科学基金会（2025M772377）、上海第九人民医院、上海交通大学医学院、细胞与基因治疗专项项目（JYXBJY001）以及三明市的支持。
