基于透明质酸的可溶解微针能够调控腺病毒疫苗中抗原的释放以及其免疫原性的路径依赖性

《Carbohydrate Polymers》：Hyaluronic acid–based dissolving microneedles regulate antigen release and route-dependent immunogenicity of adenovirus-based vaccines

基于水凝胶纳米针递送重组腺病毒疫苗，比较皮下（TDMN）和舌下（SLDMN）递送方式的免疫效果。结果显示SLDMN显著增强黏膜和系统性免疫应答，包括8.7倍高PR8 IgG、2.2倍IgA及3%肺记忆T细胞形成，其机制与舌下组织快速降解水凝胶基质、高效抗原释放及捕获机制相关，同时证实HA基固体制剂在高温和冻融条件下的稳定性优势。

　　

许秀敏（Hye Su Min）| 张恩珠（Eunju Jang）| 李友珍（Youjin Lee）| 赵成民（Sung min Cho）| 南智惠（Jeehye Nam）| 李瑟琳（Serin Lee）| 金有成（Youseong Kim）| 保罗·金（Paul Kim）| 张俊（Jun Chang）| 郑亨吉（Hyungil Jung）

韩国延世大学生物技术系，延世路50号，首尔03722

摘要

基于可生物降解聚合物的溶解型微针（DMNs）是疫苗递送的有前景的平台。然而，它们引发保护性全身性和黏膜免疫的能力因递送途径而异。在本研究中，将编码核蛋白的重组腺病毒（rAd-ANP）结合到基于透明质酸（HA）的DMNs（rAd-MNs）中，以评估TDMN和舌下DMN（SLDMN）的途径特异性免疫原性。尽管rAd-MN的剂量相同，但SLDMN表现出比TDMN更强的黏膜和全身免疫反应，包括增强的免疫球蛋白A产生和肺部组织驻留记忆T细胞的形成。具体而言，SLDMN诱导的抗PR8 IgG滴度高出8.7倍，IgA反应高出2.2倍，并选择性地促进了肺部T_RM细胞的形成（约占总T细胞的3%），而TDMN给药后T_RM细胞很少或无法检测到。这些差异与舌下组织的解剖和生理特征有关，这些特征有助于透明质酸基质的快速溶解、抗原的快速释放以及载体的有效吸收。此外，与rAd-ANP的液体配方相比，基于HA的固态基质在高温和冻融条件下的储存稳定性更好。本研究强调，DMN疫苗的性能取决于聚合物溶解行为和组织环境的相互作用，并突出SLDMN作为诱导针对呼吸道感染的保护性免疫的有希望的策略。

引言

溶解型微针（DMNs）是由可生物降解的碳水化合物聚合物（如透明质酸（HA）组成的新兴药物递送系统，它们既作为结构基质，也作为封装药物的释放控制组分（Ita, 2017; B.-M. Lee et al., 2020）。DMNs通常应用于皮肤，在微创穿透后，聚合物基质在组织液中溶解，从而以可控的方式释放封装的药物（Lau et al., 2017; Prausnitz et al., 2020）。经皮DMNs（TDMNs）被认为是有前景的下一代疫苗接种技术，因为目标递送层（表皮和真皮）中含有丰富的抗原呈递细胞（APCs）（Ita, 2017; N. W. Kang et al., 2021）。抗原释放到APCs丰富的区域会触发T细胞和B细胞的激活，产生强烈的全身性体液和细胞免疫（Koutsonanos et al., 2009; J. Li et al., 2017; Weldon et al., 2011）。因此，许多研究集中在TDMN疫苗接种上，报告了节省剂量的效果和增强的抗体诱导作用，优于传统的肌肉注射（IM）（Matriano et al., 2002; Sullivan et al., 2010; Zhu et al., 2009）。TDMNs可以引发全身免疫反应；然而，它们产生黏膜免疫的能力仍然有限。因此，对于需要强大黏膜免疫的呼吸道、胃肠道和生殖器病毒性疾病，它们可能不太适用（Monge & Verrier, 2021; Shahnoor et al., 2023）。

鉴于这些限制，有效的呼吸道疾病疫苗接种需要能够引发强烈黏膜免疫反应的策略。流感是最常见的呼吸道疾病之一，全球每年影响数百万人，世界卫生组织估计每年有高达十亿例病例（Froes et al., 2024）。流感通过呼吸道传播，因此，有效的保护需要强大的呼吸道和黏膜免疫反应。传统的全身疫苗接种方法，包括肌肉注射（IM）和TDMNs，可以有效地诱导全身性免疫球蛋白G（IgG）的产生和脾脏中的T细胞反应（Monge & Verrier, 2021; Shahnoor et al., 2023）。然而，它们在诱导黏膜分泌型免疫球蛋白A（IgA）的产生和黏膜部位的组织驻留记忆T细胞（T_RM）的形成方面存在局限性，而这些对于抵御呼吸道病原体至关重要（S. Lee et al., 2024; Renegar et al., 2004; Weldon et al., 2011）。黏膜疫苗接种策略作为克服这一限制的替代方法受到了关注。在黏膜组织中，舌下黏膜特别有利，因为它具有薄的上皮屏障、丰富的血管、高渗透性以及丰富的运动性APCs，使其成为诱导黏膜免疫（包括IgA产生和T_RM形成）的持续有效环境（Monge et al., 2022; Oberoi et al., 2016; Shahnoor et al., 2023）。这些特性使舌下途径成为针对呼吸道感染（如流感）疫苗接种的有希望的替代方案。

传统的舌下疫苗接种避免了针头注射，因为舌下组织对疼痛非常敏感（Creighton & Woodrow, 2019）。相反，疫苗通常通过将液体配方或可溶解薄膜直接放置在舌头下方来给药，从而通过黏膜表面吸收（Creighton & Woodrow, 2019）。然而，含有大分子（如亚单位蛋白、DNA、类病毒颗粒和灭活病毒）的疫苗在穿透黏膜屏障方面面临挑战（Monge et al., 2022）。此外，唾液的持续存在使得在吸收之前维持局部疫苗的效力变得困难，这对患者的便利性和疫苗效果提出了挑战（Creighton & Woodrow, 2019; Monge et al., 2022）。这些限制突显了需要一种不仅能够克服口腔生物物理屏障，还能够使用临床相关的疫苗模式（如病毒载体）有效诱导局部和全身免疫反应的黏膜递送平台。

舌下DMNs（SLDMNs）结合了基于DMN的递送优势和舌下黏膜的免疫学优势。它们可以穿透黏膜屏障并释放高分子量疫苗，随后通过舌下区域的高血流量促进吸收，而不会受到唾液的干扰（Kim et al., 2023）。最近，Kim等人引入了使用SARS-CoV-2刺突蛋白的SLDMN方法，并证明了其优于传统肌肉注射（IM）和TDMN。这些发现确立了SLDMNs作为呼吸道疾病疫苗接种的有希望的策略。尽管观察到SLDMN和TDMN在黏膜免疫反应方面存在差异，但他们没有研究递送途径如何影响免疫结果。迄今为止，还没有研究直接比较应用于不同黏膜和皮肤组织的相同DMN配方的免疫原性；这里的“免疫原性”指的是可量化的免疫反应，如体液和细胞免疫结果。与传统疫苗不同，传统疫苗的递送途径（如肌肉注射、皮内（ID）、皮下（SC）或黏膜）通常会进行优化，而DMNs几乎仅通过皮肤给药，对其他递送途径的研究有限。因此，递送途径特定的组织环境如何调节聚合物溶解、抗原扩散和载体表达的机制尚不清楚。因此，需要使用相同的DMN配方对SLDMN和TDMN进行受控的、剂量匹配的直接比较，以分离途径特定的免疫结果并阐明潜在机制。此外，病毒载体疫苗的稳定性仍然是一个主要挑战，因为液体配方在储存和运输过程中容易降解。使用基于聚合物的DMNs的固态配方通过提高热稳定性和抗冻融应力来克服这些限制，为全球疫苗分发提供了实际优势。

为了解决上述需求，我们研究了不同给药途径（舌下与经皮）下溶解型微针引发的免疫反应是否有所不同，重点是在剂量匹配的条件下进行比较。使用普埃托里科/8/1934（H1N1，PR8）流感A的保守核蛋白（NP）抗原评估了SLDMN和TDMN引发的途径特异性免疫反应，这是一种通用疫苗候选物（Lo et al., 2021; Wang et al., 2019）。在比较途径依赖的免疫之前，我们首先建立了一个实用的SLDMN给药系统，确认SLDMN的疫苗负载层在舌头应用后15分钟内溶解并能够释放有效载荷。这有助于通过确保一致的剂量来最小化与唾液相关的剂量损失，从而实现公平的途径间比较。为了准确比较免疫反应，确保了各给药途径之间的抗原剂量相同。在确认剂量相同后，通过肌肉注射、SLDMN和TDMN对小鼠进行免疫，并在血清和支气管肺泡灌洗液（BALF）中比较了特异性IgG和IgA滴度。SLDMN引发的体液和细胞免疫反应明显高于TDMN，包括IgG滴度高出8.7倍，IgA反应高出2.2倍，以及选择性诱导的肺部驻留记忆T细胞。此外，使用流式细胞术评估了NP特异性CD8⁺ T细胞和T_RM细胞的形成。最后，使用Franz细胞扩散测试评估了DMNs在皮肤和舌下黏膜中的释放动力学，并通过共聚焦成像进行了可视化。本研究表明，DMN疫苗接种的免疫原性不仅受递送途径的影响，还受到聚合物溶解动力学和组织特异性环境相互作用的影响。SLDMN引发的全身性和黏膜免疫反应更强，包括强大的肺部T_RM细胞形成（约占总T细胞的3%），而TDMN则不然。对释放曲线和组织特性的分析为这些差异提供了机制上的见解，为优化基于DMN的黏膜疫苗接种策略提供了基础。

材料

用于DMN制备的HA（32 kDa）从Uscarepharm（韩国庆畿）购买。羧甲基纤维素（CMC，90 kDa，DS:0.7）从Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）购买。用于体外研究的猪尸体皮肤由CRONEX（韩国华城）提供。用于配制的海藻糖（Tre，MW：378.33 g/mol）、蔗糖（Suc，MW：342.3 g/mol）、聚乙烯醇（PVA，30 kDa）、丝素蛋白（SF，5%溶液）和聚乙烯吡咯烷酮（PVP，K17，10,000 kDa）

rAd-MN的制备

对HA和CMC进行了表征，以验证聚合物的身份（图S1）。在FT-IR光谱（4000–350 cm^?1）中，两种聚合物都显示了特征性的多糖峰（图S1a，支持信息）。HA在大约3400 cm^?1（OH伸缩）、1600 cm^?1（不对称–COO^?伸缩）和1040 cm^?1（C–O–C/C–O伸缩）处显示出吸收峰，证实了HA中存在羟基、羧基和糖苷基团，而CMC在3400 cm^?1处显示出类似的特征

结论

我们的研究结果表明，DMN的给药途径对免疫结果有重要影响，这与配方和抗原剂量无关。通过确认通过经皮和舌下途径给予的rAd-MNs的剂量和给药量相同，我们分离出了组织特异性环境对免疫原性的影响。SLDMN引发了更强的全身性和黏膜反应，包括增强的血清IgG、黏膜IgA和肺部驻留CD8⁺ T细胞。这些结果不仅反映了免疫

CRediT作者贡献声明

许秀敏（Hye Su Min）：撰写——原始草稿、可视化、方法学、研究、数据分析、概念化。张恩珠（Eunju Jang）：撰写——原始草稿、可视化、方法学、研究、数据分析、概念化。李友珍（Youjin Lee）：撰写——审稿与编辑、研究、数据分析。赵成民（Sung min Cho）：撰写——审稿与编辑、研究、数据分析。南智惠（Jeehye Nam）：撰写——审稿与编辑、可视化、验证。李瑟琳（Serin Lee）：撰写——

资助

本研究得到了韩国健康技术研发项目通过韩国健康产业开发研究所（KHIDI）的资助，该机构由韩国卫生与福利部资助（资助编号：RS-2025-02223587，HV22C0084 / RS-2022-KH128057），并且部分工作得到了Brain Korea 21 (BK21) FOUR计划的支持。本研究还得到了首尔RISE中心通过区域创新系统与教育（RISE）的支持，该中心由卫生部资助

利益冲突声明

作者声明以下可能被视为潜在利益冲突的财务利益/个人关系：郑亨吉（Hyungil Jung）是JUVIC Inc.专利的发明人，并且是JUVIC Inc.的创始人及股东，该公司正在开发基于微针的产品。这种利益冲突已由延世大学披露。

致谢

我们感谢Jaibyung Choi、Hyeri Ahn和Eun-Ah Kim在项目初期阶段的协助。我们还要感谢延世大学纳米生物技术实验室和Ewha女子大学的免疫学实验室的研究生和本科生提供的技术支持。我们感谢延世大学的中央研究设施在共聚焦和SEM成像方面的帮助。我们感谢Editage（www.editage.com）提供的英语语言编辑服务以及BioRender的帮助