《Cellular Signalling》：A novel role of follicular fluid chemokine CCL21 in promoting porcine oocyte
in vitro maturation through activating ERK1/2 signaling pathway
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本研究通过蛋白质组学分析发现，卵巢液中的CCL21通过激活ERK1/2信号通路促进猪卵母细胞体外成熟，改善纺锤体组装、减少DNA损伤，并调节内质网稳态、降低ROS水平，为优化卵母细胞体外成熟系统提供新依据。
Ruohan Mei|Zhihao Wang|Fanglong Bi|Mingyue Sui|Mingju Sun|Zhongxiu Sun|Xuankun Hu|Youwei Li|Yanjun Huan
青岛农业大学兽医学院，中国山东省青岛市266109
摘要
卵泡液（FF）被认为能够促进卵母细胞在体外（IVM）的成熟，但导致这种效果的具体因素仍大部分未知。本研究在卵泡液中鉴定出44种细胞外特异性表达的蛋白质，其中CCL21被认为在调节卵母细胞成熟过程中起作用。用50 ng/mL的CCL21处理后，卵母细胞极体排出（PBE）的速率显著增加。此外，CCL21显著促进了纺锤体的组装，降低了DNA损伤标志物γ-H2AX的水平。更重要的是，CCL21增加了内质网（ER）的含量，减少了内质网应激（ERS）和活性氧（ROS）的水平，并增强了高尔基体亚膜的分布和谷胱甘肽（GSH）的含量。值得注意的是，CCL21还提高了p-ERK1/2的水平。进一步研究表明，使用FR180204抑制ERK1/2信号通路会显著降低p-ERK1/2的水平，破坏纺锤体的形态，并增加γ-H2AX的水平。此外，抑制ERK1/2信号通路还会显著降低ER和GSH的含量，损害高尔基体亚膜的分布，并增加ERS和ROS的水平。这些变化共同导致PBE速率显著下降。当FR180204与CCL21同时使用时，它大大逆转了CCL21对这些参数的积极作用，并抑制了PBE。总之，CCL21通过激活ERK1/2信号通路来促进猪卵母细胞的成熟。这项研究为优化卵母细胞IVM系统提供了新的见解，具有在畜牧业和人类辅助生殖技术中的潜在应用价值。
引言
卵母细胞在体外（IVM）的成熟是一项利用未开发生殖资源的重要技术，在动物胚胎工程和人类辅助生殖中起着关键作用[[1], [2], [3]]。尽管近年来IVM系统有了显著改进[2,4,5]，但卵母细胞成熟不完全仍然是一个挑战，常常导致胚胎发育不良[3,6]。
卵母细胞的成功IVM需要核成熟和细胞质成熟的协调完成[2]。核成熟包括减数分裂的重新启动，包括生殖泡破裂（GVBD）、纺锤体组装、极体排出（PBE）以及第二次减数分裂中期（MII）的停滞[7]。细胞质成熟涉及内质网（ER）、高尔基体和线粒体等细胞器的重组和功能恢复[7]。然而，目前的IVM系统无法完全模拟体内的卵泡环境[2]，使卵母细胞暴露于氧化应激和ER/Golgi应激等多种压力下，这些压力会破坏细胞器的稳态，导致纺锤体缺陷和DNA损伤[6,8,9]。这些限制影响了卵母细胞的成熟。
卵母细胞的成熟是一个由多种细胞因子调控的复杂过程[10]。卵泡液（FF）主要来源于血浆渗出物，含有多种细胞因子，构成了卵母细胞成熟的微环境[10,11]。先前的研究表明，FF中的细胞因子如表皮生长因子（EGF）、胰岛素样生长因子（IGF）和成纤维细胞生长因子（FGF）可以促进减数分裂的进展和卵母细胞的成熟[12,13]。最近的蛋白质组学分析发现了多种促进卵母细胞成熟的调节因子[14,15]。值得注意的是，我们之前的蛋白质组学研究显示，FF中的纤维连接蛋白1（Fibronectin 1）介导了细胞外-细胞内信号传导，并支持卵母细胞的IVM[16]。虽然向IVM培养基中添加FF可以引入多种促进卵母细胞成熟的特定细胞外细胞因子，但这些因子的鉴定及其机制仍不十分清楚。此外，细胞外-细胞内通讯涉及多条信号通路，其中MAPK通路对卵母细胞减数分裂的调控尤为重要[12,17]。然而，特定的FF因子如何激活信号通路以促进卵母细胞成熟仍不清楚。
猪是重要的经济家畜，与人类在解剖学、生理学和病理学上具有相似性[18]，这使得猪卵母细胞成为研究FF中特定细胞外因子在IVM过程中作用的理想模型。在本研究中，蛋白质组学分析鉴定出CCL21是一种能促进卵母细胞成熟的特定细胞外因子。随后研究表明，CCL21通过改善纺锤体组装和减少DNA损伤来促进核成熟，并通过调节内质网稳态、高尔基体分布、活性氧（ROS）水平和谷胱甘肽（GSH）含量来改善细胞质成熟。此外，CCL21还通过激活ERK1/2信号通路来促进卵母细胞的成熟。这项工作突出了FF中特定细胞外因子CCL21在卵母细胞IVM中的关键作用，并为建立更高效的IVM系统提供了新的见解。
章节摘录
化学试剂
除非另有说明，所有化学试剂均购自Sigma-Aldrich（美国密苏里州）。所有实验程序均得到了青岛农业大学动物护理委员会的批准。
蛋白质组学分析
蛋白质组学分析按照我们之前的报告[16]进行。简而言之，我们使用了无标记液相色谱串联质谱（LC–MS/MS, PTM BIO）来比较血清和卵泡液中的蛋白质谱型，重复了3次。分析前，血清和卵泡液样本已
确定CCL21为促进卵母细胞在体外成熟的具体因子
如图1A和S2表所示，在F（卵泡液）组中鉴定出328种细胞外分泌蛋白（SEPs）。亚细胞定位分析显示，其中55种SEPs位于细胞外基质中，其中44种细胞外SEPs被鉴定为F组中的成分（见图1B和C）。GO分析表明，这44种SEPs主要参与细胞过程、细胞或结合，分别属于BP（胞质基质）、CC（细胞骨架）或MF（膜）类别。KEGG图谱进一步显示，这些SEPs与细胞群落-真核生物、信号转导、代谢等相关
讨论
卵母细胞IVM是动物胚胎工程和人类辅助生殖中的基础技术[2]。尽管FF已被证明可以促进卵母细胞的IVM[16]，但导致这种效果的具体因素仍不清楚。在本研究中，蛋白质组学分析鉴定了卵泡液中的细胞外SEPs，其中CCL21被认为可以调节卵母细胞的成熟。向不含FF的IVM培养基中添加CCL21显著提高了PBE率和囊胚形成率。此外，CCL21还改善了多个方面
CRediT作者贡献声明
YJH设计了研究并撰写了手稿。RHM、ZHW和FLB主要进行了实验。MYS、MJS、ZXS和XKH参与了实验和数据分析。YWL对手稿进行了修订。所有作者都已阅读并批准了最终版本的手稿。
资助
本研究得到了国家自然科学基金（编号32272969）、泰山学者专项基金（编号tsqn202211191）以及山东省自然科学基金（编号ZR2024MC105）的支持。
