《Comparative Biochemistry and Physiology Part D: Genomics and Proteomics》：Molecular characterization of ionotropic receptors of a parasitic copepod
Caligus fugu (Crustacea: Copepoda)
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本研究聚焦于对养殖虎河豚产业构成重大威胁的寄生桡足类——虎河豚海虱（Caligus fugu）的化学感应机制。由于桡足类通常缺乏气味受体和味觉受体，离子型受体（IRs）在其感知环境与宿主信号中扮演关键角色。为解决其IR基因功能序列缺失的问题，研究人员结合de novo转录组分析和Sanger测序，成功鉴定并表征了C. fugu的四个IR基因（IR21a、IR25a、IR40a和IR93a）。通过系统发育、结构域分析和3D建模证实了其作为功能性化学感应受体的特征，并发现这些基因在具有感染性的桡足幼体I（CI）阶段表达量显著高于自由生活的无节幼体II（NII）阶段。该研究为理解C. fugu的宿主寻找行为提供了分子基础，对开发基于干扰化学感应的新型防控策略具有重要意义。
在水产养殖业中，寄生性桡足类海虱的侵扰是一个持续存在的挑战，它们附着在鱼类体表，引发压力、继发感染并造成严重经济损失。其中，虎河豚海虱（Caligus fugu）已成为养殖河豚产业的一大威胁。这类寄生虫的生命周期复杂，包含自由生活和寄生阶段，其成功感染的关键在于感染性幼虫（桡足幼体I，CI）能够精准定位并附着到合适的宿主上。这一过程高度依赖于化学感应——即通过感知溶解在水中的宿主释放的化学信号来导航。然而，与昆虫等生物不同，桡足类的化学感应系统被认为主要由一类称为离子型受体（Ionotropic Receptors, IRs）的古老蛋白质家族主导，因为它们通常缺乏常见的气味受体和味觉受体。尽管其近亲物种如鲑鱼海虱（Lepeophtheirus salmonis）的IRs已有研究，但关于C. fugu的IR基因，我们几乎一无所知。其完整的、功能性的IR编码序列尚未被鉴定，这阻碍了我们从分子层面理解其宿主寻找行为，也限制了针对性防控策略的开发。
为了解决这一知识空白，并深入探究C. fugu化学感应的分子机制，由K.M. Shakil Rana、Zhang Junji、Tomonari Kotani和Satoshi Tasumi组成的研究团队，在《Comparative Biochemistry and Physiology Part D: Genomics and Proteomics》上发表了一项研究。他们旨在通过分子生物学与生物信息学相结合的手段，系统鉴定并表征C. fugu的关键IR基因，并探究其在感染阶段可能发挥的作用。
研究人员采用了几个关键技术方法来推进这项研究。首先，他们利用前期工作中构建的C. fugu三个发育阶段（NII, CI, CII）的de novo转录组数据作为参考，筛选出与已知IR相似的序列。样本来源于在日本鹿儿岛市采集的虎河豚（Takifugu niphobles）体表获取的产卵雌性C. fugu，并在实验室条件下孵化、收集了NII和CI阶段的个体。其次，他们通过Sanger测序验证并获取了完整的开放阅读框（ORF）序列。接着，利用系统发育分析、同源性搜索（BLASTP）、保守结构域预测（如InterPro、TMHMM）以及AlphaFold2三维结构预测，对确认的IR序列进行了进化和结构表征。最后，通过实时定量PCR（qPCR）技术，比较了IR基因在自由生活的NII阶段和感染性的CI阶段之间的相对表达差异，以推断其功能相关性。
研究结果通过多个层面逐步揭示了C. fuguIRs的特征：
3.1. 筛选de novo组装的IR样基因并通过Sanger测序确定IR编码序列
研究人员从转录组数据中鉴定出八个与IR21a、IR25a、IR40a和IR93a相似的表达基因ID。通过PCR扩增和Sanger测序，他们成功确认了来自四个不同Trinity基因ID（分别对应IR21a、IR25a、IR40a和IR93a）的完整开放阅读框（ORF）。其中，IR93a的序列直接测序结果清晰单一，表明其为单拷贝基因；而其他三个IR的克隆序列则显示出一定的多态性，通过多数原则获得了共识序列。其余预测的IR样转录本或因移码突变、或因未能扩增，未被确认为功能性IR。这确保了后续分析基于的是经过实验验证的、潜在具有生物学功能的基因拷贝。
3.2. C. fuguIRs的系统发育分析
为了确定这些IRs的进化地位，研究人员构建了包含145个来自不同桡足类物种IRs的最大似然系统发育树。分析显示：C. fuguIR25a和IR93a与来自其他桡足类（如L. salmonis、Tigriopus californicus等）的同源序列形成了明确且支持度高的聚类，表明它们是高度保守的直系同源基因。相比之下，C. fuguIR21a虽然与L. salmonis和Eurytemora carolleeae的IR21样序列位于同一分支，但处于较远的位置，暗示其经历了谱系特异性的分化。而C. fuguIR40a则未与数据库中现有的桡足类IR40a序列（仅来自L. salmonis）聚类在一起，这可能是因为公共数据库中桡足类IR40a的代表性有限，影响了其进化位置的准确判定。
3.3. 使用BLASTP进行C. fuguIRs的同源性搜索
BLASTP蛋白质序列比对进一步证实了这四个IRs的身份。所有C. fuguIRs都显示出与近缘寄生性桡足类（如L. salmonis和Caligus rogercresseyi）的同源蛋白具有最高的序列相似性，支持了它们在宿主识别等生物学功能上的保守性。其中，IR25a与C. rogercresseyi的IR25a一致性高达91.15%，显示了极强的保守性。
3.4. C. fuguIRs的结构评估
通过多种生物信息学工具（InterPro, TMHMM, Phobius等）对蛋白质结构域进行分析，发现这四种IRs均具备IR家族的典型结构特征。它们都包含配体结合域（Ligand-binding domain, LBD）和三个跨膜螺旋（Transmembrane helices），这与其作为配体门控离子通道的功能一致。值得注意的是，调谐受体（tuning receptors）IR21a和IR40a以及辅助受体（coreceptor）IR93a均未检测到明显的氨基末端结构域（Amino-terminal domain, ATD），这与许多节肢动物IRs的结构特征相符。而辅助受体IR25a通常含有ATD，但在C. fugu中未检测到，可能反映了物种特异性序列差异。此外，IR93a在最后一个跨膜螺旋后缺乏预测的胞质羧基末端结构域（Cytoplasmic carboxy-terminal domain, CTD）。尽管存在这些细微差异，保守的LBD和TMD拓扑结构支持了C. fuguIRs功能结构的进化保守性。利用AlphaFold2进行的3D结构预测模型显示，IR21a、IR25a和IR93a的模型置信度较高，并展现出典型的“Venus flytrap”状LBD折叠和跨膜区；而IR40a的模型置信度较低，可能与其序列独特性有关。
3.5. C. fuguIR基因在NII和CI阶段的相对表达
为了探究这些IRs在感染过程中的潜在作用，研究人员比较了它们在自由生活的无节幼体II（NII）阶段和感染性桡足幼体I（CI）阶段的表达水平。qPCR结果表明，所有四个IR基因（IR21a、IR25a、IR40a和IR93a）在CI阶段的表达量均显著高于NII阶段。其中，IR25a的表达上调效应量最大。这一表达模式强烈暗示，这些IRs在C. fugu寻找并感染宿主的关键阶段扮演着重要角色。
研究结论与重要意义
本研究成功鉴定并表征了寄生桡足类虎河豚海虱（Caligus fugu）的四个离子型受体（IRs）：IR21a、IR25a、IR40a和IR93a。通过结合de novo转录组分析和Sanger测序，研究人员获得了这些基因的功能性编码序列。系统发育和同源性分析确认了它们的身份，并揭示了其与近缘物种IRs的进化关系。结构域分析和3D建模表明，这些蛋白拥有IR家族典型的配体结合域和跨膜通道结构，支持其作为化学感应受体的功能。尤为重要的是，所有四个IR基因在感染性CI阶段的表达量均显著上调，这与其在宿主寻找行为中可能起到的化学感应功能高度吻合。
这项研究具有多重重要意义。首先，它填补了C. fugu分子生物学研究的空白，首次系统鉴定了其关键的化学感应受体基因，为理解这种重要寄生虫的宿主识别机制提供了直接的分子靶点。其次，研究揭示了IRs在寄生虫感染阶段特异性高表达的模式，这为了解寄生虫生命史中化学感应行为的调控时机提供了线索。从应用角度看，这些IRs，尤其是高表达的IR25a，可作为潜在的干预靶点。未来通过基因敲低（knockdown）或利用化学抑制剂干扰这些受体的功能，可能扰乱C. fugu的宿主定位能力，从而为开发新型、环境友好的寄生虫防控策略奠定理论基础。最后，研究所采用的结合转录组学、分子验证和生物信息学分析的方法，为研究其他非模式生物、缺乏基因组数据的物种的化感基因提供了可借鉴的流程。总之，这项工作不仅增进了我们对寄生性桡足类化感机制的基础认识，也为解决水产养殖中的实际寄生虫问题开辟了新的分子探索路径。
