《PLOS Biology》：Light intensity and opsin sensitivity shape the morphology of cone photoreceptor outer segments
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本篇研究深入探讨了脊椎动物视锥细胞外段（OS）形态多样性的形成机制。研究发现，斑马鱼四种视锥细胞的外段长度与其表达的视蛋白的光谱灵敏度直接相关，长波长敏感的视锥拥有更长的外段。研究进一步揭示，通过改变视蛋白表达类型（如异位表达绿、红或海龟长波视蛋白）或调节光强（包括异位诱导脂滴形成或改变饲养环境），均可引发视锥外段形态的长期、可塑性改变。这提示视锥外段形态是光感受器适应光照条件的一种动态调节机制，其调控可能依赖于长期的神经活动，为我们理解神经可塑性和感官适应提供了新的视角。
变异在斑马鱼视锥外段的形态学中
作为昼行动物，斑马鱼与人相似，主要依赖视锥细胞进行白昼视觉。其视网膜含有五种光感受器：一种视杆细胞和四种视锥细胞。利用小麦胚芽凝集素（WGA）染色，可以区分不同光感受器类型的外段，它们被组织成不同的层次。在靠近视网膜色素上皮（RPE）的顶端区域，视杆外段层位于最顶部，其后是双锥和蓝锥外段层，UV锥外段层位于最基底的位置。
为了进一步研究视锥外段的形态，研究者使用了两种转基因斑马鱼系，Tg(sws1:sws1-GFP)和Tg(sws2:HA-tdTomato-CT44)，分别标记UV锥和蓝锥的外段。双锥（红锥和绿锥）的外段则通过组合WGA和Zpr3抗体染色来识别。外段长度的测量显示，视杆的外段最长，平均长度约35 μm (±3.76)。在视锥外段中，UV锥外段最短，约10 μm (±0.49)，蓝锥外段平均长度为12.5 μm (±1.33)。红锥和绿锥的外段则显著长于蓝锥和UV锥，红锥外段略长于绿锥外段。此外，不同外段的宽度测量显示，视锥外段的宽度与其长度呈负相关。外段长度与宽度的比值进一步突显了不同光感受器类型外段之间的显著形态学差异。超微结构分析也证实了这些形态差异。
UV视蛋白对于维持UV锥至关重要
为了研究调节外段长度的机制，考虑到视蛋白是外段中最丰富的蛋白质，研究者生成了缺乏视锥视蛋白的斑马鱼突变体。他们设计了靶向UV视蛋白基因第二外显子的sgRNA，导致移码突变，造成C端214个氨基酸的缺失。该突变导致突变体在受精后5天幼虫中的mRNA表达量显著降低，可能是由于无义介导的衰变。WGA免疫染色显示，在突变体的幼虫和成体阶段，UV锥外段均未能发育。在缺乏外段的情况下，UV锥在约7 dpf时开始退化，在成鱼中几乎完全缺失。
在UV锥中异位表达视锥视蛋白
为了验证UV视蛋白是否可以被其他视蛋白功能性地替代，研究者首先生成了一个GFP标记的UV视蛋白转基因。尽管GFP融合蛋白成功地被靶向到UV锥外段，但在缺乏Sws1的情况下，它未能挽救UV锥的变性。相反，表达全长、无标签UV视蛋白的转基因品系则完全挽救了UV锥的变性。
接下来，研究者探究异位表达其他视蛋白是否能挽救突变体中的UV锥变性。他们生成了表达绿视蛋白、红视蛋白和视杆视蛋白基因的转基因。引人注目的是，所有这些转基因都挽救了sws1突变体中UV锥外段的缺失。这些被挽救的UV锥数量与野生型相似。值得注意的是，在幼虫阶段，对照组和转基因品系之间的外段长度是可比的，而在成年斑马鱼中，通过异位表达绿视蛋白或红视蛋白基因，被挽救的UV锥外段表现出显著更大的伸长。统计分析表明，这些被挽救的外段类似于双锥中的绿锥或红锥外段，尽管它们位于视网膜的不同层次。异位表达视杆视蛋白基因也挽救了视锥外段，而被挽救的外段形态与UV锥外段相似。进一步的TEM超微结构分析显示，携带Tg(sws1:lws1)转基因的sws1突变体，被挽救的“UV锥”外段被正确定位于蓝锥外段下方，但其形态发生了显著改变，与双锥的形态非常相似。
异位表达视锥视蛋白可以改变视杆外段的形态
为了探究异位表达视锥视蛋白是否会影响视杆外段的形态，研究者也生成了视紫红质突变体，并确认了突变体幼虫中视紫红质表达的降低。与先前发现一致，视紫红质基因突变导致视杆光感受器快速变性。研究者随后创建了两个转基因品系，Tg(xops:rhodopsin)和Tg(xops:lws1)，它们在非洲爪蟾视紫红质基因启动子下表达视紫红质或lws1基因。表达视紫红质完全挽救了视紫红质突变体中的外段缺失表型。引人注目的是，异位表达红视蛋白基因也在幼虫和成体中部分挽救了视杆外段形成。有趣的是，在成体中，这些被挽救的外段变得细长，类似于红锥外段。此外，表达红视蛋白的视杆细胞的外段主要位于视锥外段层内。这些结果表明，通过简单地用视锥视蛋白替换视杆视蛋白，可以改变视杆外段的圆柱形形态。
视锥外段形态与相应视蛋白的吸收波长直接相关
鉴于不同的视蛋白吸收不同波长的光，研究者假设光感受器外段的形态可能受视蛋白吸收的光波长影响。有趣的是，斑马鱼UV锥拥有最短的外段，对应于最短波长的光——紫外光。相反，红锥拥有最长的外段，这与最长波长的光——红光——相对应。
这引发了一个问题：如果UV锥细胞表达一种吸收波长长得多的视蛋白，其外段是否会伸长？为了探究这一点，研究者生成了一个表达海龟长波视锥蛋白的转基因。这种视蛋白的吸收波长显著长于斑马鱼红视蛋白。引人注目的是，当海龟LWS在UV锥细胞中表达时，这些细胞保持了其典型的视锥形态，但发育出了长约24 μm (±1.25)的外段，明显长于在斑马鱼双锥细胞中观察到的约20 μm的外段。
视蛋白需要发色团来吸收光并启动光转导级联反应。值得注意的是，许多水生动物拥有维生素A1-A2视觉色素系统。例如，斑马鱼光感受器主要含有基于维生素A1的色素，但甲状腺激素处理可以诱导其转化为基于维生素A2的色素，导致吸收的光波长向更长波长方向移动。引人注目的是，甲状腺激素处理也引起了红锥外段显著的伸长。这进一步证实了光感受器外段的长度与视蛋白吸收的光波长相关联。
视锥外段对不同光照强度的环境适应
根据光学理论，光的波长与其能量直接相关，较短的波长（如紫外光）具有最高的能量。视锥外段形态随光波长变化而改变的现象表明，光能量可能在决定外段长度方面起着关键作用。为了进一步研究，研究者探究改变到达外段的光强度是否同样能影响其长度。为了测试这一点，他们将斑马鱼从受精后一个月开始，分别在标准光照或弱光下饲养。一个月后，在弱光下饲养的斑马鱼，其视锥外段相比于标准光照条件下的个体表现出显著的伸长，这在双锥中尤为明显。
在许多物种中，视锥细胞进化出一种称为油滴或脂滴的光学细胞器，位于内段。这些油滴或脂滴通过调节传输到外段的光强度，在光感受器激活中起着至关重要的作用。因此，研究者考察了在斑马鱼视锥中诱导油滴形成是否能够改变视锥外段的形态。CIDEA是脂滴融合的关键因子，在鸟类的视锥中高表达。CIDEA与SPDL1-L共同调节鸡视锥中油滴的形成和定位。有趣的是，斑马鱼的Spdl1基因座仅编码Spdl1-S亚型。因此，研究者生成了一种嵌合蛋白，将斑马鱼Spdl1与人类SPDL1-L蛋白的C端序列结合。然后，他们建立了稳定的转基因斑马鱼品系，在sws1启动子控制下共表达该嵌合构建体和斑马鱼Cidea，预期能特异性地在UV锥中诱导脂滴形成。在幼虫阶段，在UV锥的内段观察到了脂滴，并且这些脂滴在光感受器中持续到成体阶段。值得注意的是，某些UV锥中的部分脂滴在发育过程中开始降解，但仍有相当数量的UV锥保留了脂滴。接下来，研究者比较了这些光感受器的外段长度。虽然在10 dpf时，对照组和转基因幼虫的外段长度没有差异，但在含有脂滴的成体视锥中，外段长度显著增加。即使在同一个视网膜内，含有脂滴的UV锥也比不含脂滴的UV锥拥有显著更长的外段。这些发现表明，异位脂滴也能诱导视锥外段的伸长。
最后，研究者探究这种长度适应是否也发生在自然条件下。在海洋中，光强度随着深度的增加因吸收和散射而急剧下降。研究者比较了野生黑鲉和养殖黑鲉的视锥外段。野生黑鲉通常栖息在20米到超过300米的深度，而养殖黑鲉则饲养在沿海浅水区。利用WGA和双锥特异性抗体Zpr1的组合染色，研究者容易地在野生和养殖鱼中识别出双锥外段。引人注目的是，野生鱼中的双锥外段也显著长于养殖鱼。这些发现表明，光强度的变化也有助于调节视锥外段的长度。
视锥外段形态的变异在不同物种中是保守的
研究已证明斑马鱼视锥外段的形态在不同亚型之间存在显著差异，长波长敏感的视锥拥有更长的外段。最后，研究者探究这种模式是斑马鱼特有的，还是在更广泛的物种中是保守的。在硬骨鱼中，研究者观察到相似的视锥外段长度变异。引人注目的是，尽管这些物种之间的视锥宽度是可比的，但不同视锥之间的长宽比存在显著差异，这可能反映了对特定生态位的光适应。研究者还检查了兔子的视锥外段形态，兔子拥有对蓝光和绿光敏感的两种视锥类型。值得注意的是，这两种视锥类型在兔子视网膜中表现出显著不同的外段长度。同样，在人类中央凹，S锥也表现出比M/L锥更短的外段长度。这些观察共同表明，视锥外段长度的变异是脊椎动物物种中一个保守的特征。
基于这些发现，研究者提出了一个调节视锥外段长度的模型。研究表明，外段的伸长似乎不是由于视蛋白积累增加所致。在sws1杂合突变体中，尽管sws1表达大幅减少，UV锥外段的大小与野生型成体相当。此外，异位表达的lws1的表达水平甚至低于Tg(sws1:sws1)品系中的sws1。这些发现表明，除了总视蛋白量之外的因素也参与了视锥外段形态的调控。
研究者提出了几种可能影响外段长度的机制。首先，视蛋白之间细微的结构差异可能影响它们在膜内的折叠或相互作用，从而改变外段内盘膜的组成或堆积。其次，视蛋白通过纤毛运输系统被运输到外段，运输效率可能在视锥亚型之间存在差异。这种差异也可能影响膜运输调节因子的招募。最后，RPE细胞光感受器盘膜的脱落率可能在视锥类型之间存在差异，可能有助于外段稳定性和长度的不同。
研究者认为，外段修饰的关键调节因子是神经活动。这得到了以下发现的支持：在幼虫阶段，异位视蛋白表达和脂滴诱导实验中的UV锥外段长度仍然与野生型对照组相似。值得注意的是，当携带Tg(sws1:lws1)的鱼在完全黑暗的条件下饲养时，“UV锥”外段的伸长显著减少。此外，即使在成鱼中，弱光孵育也增加了视锥外段的长度。这些结果突显了神经活动是控制视锥外段形态可塑性的一个关键因素。
神经活动如何影响视锥外段的形态？为了将视觉信号从光感受器传递到下游双极细胞，光感受器必须在其突触末端持续调节神经递质的释放。这种持续的突触输出取决于光转导级联反应产生的足够电反应。这个级联反应的第一步是视蛋白在外段中吸收光子能量。因此，外段必须捕获足够的光能量以达到信号启动的阈值。光子捕获效率取决于两个主要因素：单个光子的能量以及光色素捕获的光子数量。因此，携带较高能量的短波长光子更有可能有效地激活其相应的视蛋白。相反，将视蛋白表达从短波长变体切换到长波长变体可能会降低光转导过程中的激活效率。类似地，到达外段的光子数量减少也会进一步降低视蛋白的激活效率。为了补偿降低的激活效率，动物可能采取另一种策略——增加光路中可用的视蛋白数量，从而增强外段内的光子捕获。这种机制可能会驱动外段的伸长。这种形态适应可能需要长时间的调整，并可能由神经活动依赖的机制介导。尽管将神经活动与外部段重塑联系起来的分子和细胞通路尚不清楚，但来自下游双极细胞的反馈信号可能有助于调节外部段长度，这一观点值得未来研究。
总之，研究发现光感受器外部段的形态与其表达的视蛋白类型直接相关。视蛋白的波长灵敏度越长，视锥外部段越长。这种调控可能是通过长期的环境适应或神经活动实现的。这些结果为光感受器外部段的发育提供了新的见解，并对影响外部段结构的因素提供了新的理解。
