监管重塑驱动枯草芽孢杆菌种内竞争：群体感应失调作为快速适应策略

《PLOS Genetics》：Regulatory rewiring drives intraspecies competition in Bacillus subtilis

本研究揭示了微生物种内竞争的新机制：在模式生物枯草芽孢杆菌中，关键群体感应（Quorum Sensing， QS）通路的自然变异或实验演化性破坏，可迅速赋予菌株生长优势和竞争优势。文章通过建模、突变分析、实验演化和比较基因组学等多重手段，系统阐明了RapP-PhrP3610模块及ComP激酶的失活如何通过解除对ComA的抑制、加速生长，并在结构化生物膜群落中驱动竞争排斥。研究发现，即使在预期合作行为占优的结构化环境中，群体感应机制也可能被“舍弃”。对370个基因组的调查显示，约16%的自然分离株携带破坏性comP突变，凸显了该策略在进化上的普遍性。此外，研究还指出，生长速率并非决定竞争结果的唯一因素，VII型分泌系统毒素YwqJ等效应分子也扮演重要角色。这项工作从根本上揭示了微生物种群中个体适应度与群体信号传导之间的权衡，为理解微生物群落结构和进化动力学提供了新视角。

　　

信号不响应的RapP影响枯草芽孢杆菌NCIB 3610的成对种内竞争结果

研究首先聚焦于模式菌株枯草芽孢杆菌NCIB 3610，该菌株在与多种其他枯草芽孢杆菌分离株共培养时表现出强大的竞争优势。其独特的RapP-PhrP³⁶¹⁰模块是关键因素。该模块中的RapP蛋白因第236位氨基酸的苏氨酸取代（N236T），而对其信号肽PhrP不敏感。这导致RapP持续发挥磷酸酶活性，使转录调节因子ComA的磷酸化水平（ComA~P）在细胞高密度时仍保持在低位，从而解除了群体感应对生长的抑制，实现了更快的生长速率。

为验证这一假设，研究团队采用了已有的数学模型进行模拟，该模型描述了两种菌株在单个生长生物膜中的时空动力学。模拟结果显示，当其他条件相同时，即使微小的倍增时间差异，也能导致具有更短倍增时间的菌株在成对竞争中迅速占据主导地位。这从理论上支持了生长速度优势的竞争效应。

实验上，构建了NCIB 3610的ΔrapP突变株。该突变株形成了粘液状菌落生物膜，与许多环境分离株的表型相似，并且在浮游生长条件下，其倍增时间比野生型NCIB 3610长约1.4倍。在双菌株菌落生物膜竞争实验中，NCIB 3610能够轻松淘汰ΔrapP突变株，而仅携带不同荧光报告基因的同基因型菌株之间则能稳定共存。这直接证明了RapP³⁶¹⁰对于NCIB 3610的竞争适应性至关重要。

RapP对一系列枯草芽孢杆菌分离株竞争结果的影响

为了深入探究RapP的作用，研究比较了NCIB 3610 ΔrapP突变株与一系列野生型枯草芽孢杆菌分离株的竞争结果。研究发现，RapP对NCIB 3610高竞争表型的贡献具有菌株依赖性。一些原本能与NCIB 3610低水平共存的菌株，在与ΔrapP突变株共培养时，在成熟生物膜中的比例显著增加。而另一些被NCIB 3610完全淘汰的菌株，即使面对ΔrapP突变株也几乎无法被检测到。这种RapP介导的竞争效应与共培养菌株同NCIB 3610在系统发育上的亲缘关系呈正相关，亲缘关系越近，RapP的影响越大。

生长速率测定表明，尽管这些被测菌株的倍增时间均显著慢于NCIB 3610，但与NCIB 3610 ΔrapP突变株相当，这说明生长速率并非决定相互作用结果的唯一因素。对370个完整基因组的分析显示，携带完整rapP-phrP基因的菌株相对较少，其中仅有7株携带与NCIB 3610相同的不响应PhrP信号的rapP变体。

作为反向验证，研究将RapP-PhrP³⁶¹⁰编码区引入到三个野生分离株（NRS6105， NRS6145， NRS6202）中。引入后，这些菌株获得了类似NCIB 3610的菌落生物膜形态，倍增时间缩短，并且在面对NCIB 3610的竞争时，生存能力显著增强。这证明RapP-PhrP³⁶¹⁰可以作为一种显性元件，通过加速生长来提升菌株的竞争适应性。

枯草芽孢杆菌土壤分离株的实验演化

鉴于rapP在自然种群中的相对稀有性，研究通过实验演化探寻其他能够增强菌株（通常被NCIB 3610淘汰）耐受竞争的遗传适应性。选择了三个在与NCIB 3610竞争中处于劣势但仍能以低比例存活的菌株（NRS6105， NRS6145， NRS6202）进行连续传代共培养。

经过6轮演化，在27个谱系中，有4个谱系（来自三个亲本菌株背景）获得了与NCIB 3610更好共存的能力。这些演化菌株形成的混合生物膜呈现出独特的空间分布：演化菌株占据生物膜中心，而NCIB 3610环绕在外围。同时，演化菌株的单菌落生物膜也变得不那么粘液状，且占据的面积更小。

对演化菌株进行基因组测序发现，在四分之三的谱系中，突变都发生在comP编码区，这是枯草芽孢杆菌群体感应系统的核心组件。这些突变包括导致蛋白截短的移码突变、17个氨基酸（第633-649位）的框内缺失以及一个氨基酸替换（E510K）。结构建模分析表明，这些突变很可能会破坏ComP的功能。另一个谱系则出现了一个包含rhgR1基因在内的大片段缺失，该基因编码多种Rap磷酸酶的阻遏蛋白。这些发现表明，破坏ComQXPA系统是实验室演化中反复出现的适应策略。

comP突变在枯草芽孢杆菌分离株基因组中的检测

实验演化中comP突变的高频出现，促使研究者探究此类突变在自然种群中是否普遍存在。通过对370个高质量枯草芽孢杆菌基因组进行分析，并聚焦于comP序列，研究发现了60个携带破坏性comP等位基因的基因组，占数据集的至少16%。这些破坏性突变（包括无义突变、移码、框内缺失和转座子插入）广泛分布于整个comP编码序列，并且散在分布于系统发育树的不同分支中。

一个值得注意的现象是，一组亲缘关系密切的菌株在一个聚胸腺嘧啶序列（连续8个T）处发生了突变，这可能是复制过程中链滑动错配导致的热点突变。这些菌株分离自多种环境（如根际土壤、植物组织、水体、人类粪便等），且都隶属于与NCIB 3610相同的群体感应型（Pherotype）。这一发现表明，comP失活突变在自然和人为环境中广泛存在，并且可以在特定群体感应型中趋同进化。

ComQXPA群体感应系统突变的影响

为了验证ComP在塑造种内相互作用中的作用，研究在NRS6105中重构了comP_Δ633–649缺失和完整的comP框内缺失突变。在双菌株生物膜竞争中，这两个comP突变株相较于其亲本菌株，在与NCIB 3610共存的水平上都有显著提高，表型与实验演化获得的菌株相似。此外，构建的NRS6105 ΔcomA突变株也表现出竞争适应性的增强，表明破坏ComP-ComA调控轴可以提升菌株在混合生物膜中的竞争力。

这种竞争优势并非仅限于与NCIB 3610的互作。当这些comP或comA突变株与其各自的亲本菌株竞争时，它们都能在生物膜中占据几乎全部空间，强烈地淘汰了亲本菌株。然而，在NCIB 3610自身背景下引入comP或comA突变，由于其已存在不响应的RapP³⁶¹⁰，所产生的竞争表现变化则相对较小。

生长速率测定显示，在除NCIB 3610以外的所有测试背景中，缺失comP或comA均能缩短倍增时间。例如，NRS6105 ΔcomP以及演化菌株NRS6145 L1P4和NRS6202 L6P4在指数期的生长速率都接近NCIB 3610，并与其亲本菌株有显著差异。这说明生长速率的不平等是突变株淘汰亲本株的主要驱动力，也是这些突变株能够与NCIB 3610共存的基础。

最后，研究探讨了NCIB 3610中ComA与RapP的关系。由于RapP-PhrP³⁶¹⁰已使NCIB 3610的ComA~P活性维持在低位，研究者假设comA对rapP具有上位性。实验构建了NCIB 3610 ΔrapPΔcomA双突变株，发现其在生物膜形态和竞争适应性上更接近于ΔcomA单突变株，但并未完全达到ΔcomA单突变株的共存水平。值得注意的是，尽管双突变株的生长速率恢复到了与野生型相当的水平，但其竞争适应性并未完全恢复。这表明RapP对NCIB 3610竞争力的影响仅部分是通过ComA介导的，并且仅仅使生长速率相等并不能保证在菌落生物膜中共存。

探寻特定的竞争决定因子

为了探索NCIB 3610竞争优势的分子基础，研究者对生长速率相当但竞争结果迥异的NCIB 3610及其ΔrapPΔcomA双突变株进行了转录组分析。尽管浮游生长速率相似，但双突变株中与生长和代谢相关通路的下调，表明代谢重排可能影响了竞争结果。

鉴于蛋白质毒素在种内竞争中的作用，研究重点关注了89个已知毒素及相关转录本。发现ywq操纵子（与VII型分泌系统相关的毒素编码基因簇）的所有成员在ΔrapPΔcomA突变株中均被显著下调超过2倍。生物信息学分析显示，NCIB 3610所携带的VII型分泌系统毒素基因（含LXG结构域）在不同环境分离株中的存在情况差异很大。值得注意的是，那些能与NCIB 3610衍生物（ΔrapP）较好共存的菌株，其VII型分泌系统毒素库与NCIB 3610更为相似。

为验证ywqJ的作用，在NCIB 3610中构建了ΔywqJ突变株。竞争实验表明，ΔrapPΔcomA突变株在与ΔywqJ突变株共培养时，其存活率相较于与野生型NCIB 3610共培养时有显著提高。这些结果共同表明，ywqJ编码的毒素是种内竞争的一个关键决定因子，但可能并非唯一的因素，因为两个竞争菌株在共培养后并未达到完全均等的比例。

讨论：群体感应失调作为竞争优势策略

本研究揭示了在枯草芽孢杆菌中，破坏关键的群体感应通路（无论是通过自然变异还是实验演化）能赋予显著的适应性优势，即使在结构化生物膜群落这种预期会利于合作性状进化的环境中也是如此。具体而言，NCIB 3610菌株中不响应信号的RapP-PhrP模块，以及comP传感激酶的自发突变，都能通过促进生长和竞争排斥来增强菌株优势。然而，生长速率并非唯一决定因素，具有相当生长速率的菌株间仍会因VII型分泌系统底物谱等差异而产生拮抗作用。

这种通过抑制群体感应信号来换取个体竞争利益的权衡，在其他细菌系统中也得到印证，例如在慢性感染中常出现的铜绿假单胞菌lasR突变株。对自然基因组的分析进一步证实，破坏性comP突变并非罕见，至少在16%的野生分离株中存在，特别是在与NCIB 3610共享群体感应型的菌株中，这表明这是一种在竞争压力下被自然选择的反复出现的策略。

竞争结果的决定是复杂的。虽然生长速率是强有力的预测指标，但本研究表明，具有相同倍增时间的菌株会因其调控配置的不同而产生截然不同的竞争结果。转录组分析将其中一个贡献因素指向了VII型分泌系统底物YwqJ的差异表达。毒素介导的干扰可以在生长速率较慢的情况下仍赋予竞争优势。

重要的是，破坏ComA介导的群体感应所带来的益处似乎是情境依赖的。在本研究的双菌株模型中，所有竞争者都属于同一物种，且对彼此的次级代谢产物相对耐受，此时产生ComA调控性状的能量成本可能超过其效用。相反，当面对系统发育上遥远的物种时，枯草芽孢杆菌可能会更多地投资于次级代谢产物。这表明，群体感应抑制在种内竞争中是有益的，但在更广泛的生态背景下，当毒素生产对生存至关重要时，则可能有害。

综上所述，这项研究揭示了通过遗传破坏或自然变异来调控群体感应，是介导微生物种群竞争的一种有力机制。它突出了调控网络的进化可塑性，并表明合作的生态价值高度依赖于群落组成和环境结构。整合生长动力学、调控复杂性、空间生态学和菌株间拮抗作用的系统层面理解，对于预测和操控微生物群落的结果至关重要。