《PLOS Genetics》：Cholinergic signaling modulates intestinal pathophysiology in a drosophila model of cystic fibrosis
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本文利用果蝇肠道模型，揭示了囊性纤维化（CF）中CFTR功能缺失导致胆碱能信号传导减弱的全新机制。研究发现，肠细胞特异性敲低Cftr会显著上调乙酰胆碱酯酶（Ace）表达，并通过转录因子Fkh（FOXA1/A2同源物）介导，进而损害肠道动力、营养吸收及屏障功能。重要的是，通过敲低Ace恢复胆碱能信号可挽救多种CF表型，提示增强胆碱能信号或可作为CF胃肠道症状的潜在治疗策略。
在果蝇中肠敲低Cftr重现了囊性纤维化的临床病理
本研究建立了一个果蝇肠道特异性囊性纤维化（CF）模型，通过在肠细胞中利用Myo1A-Gal4驱动UAS-CftrRNAi进行Cftr的条件性敲低。该模型成功地重现了人类CF患者常见的多种胃肠道临床病理特征。首先，CF模型果蝇表现出肠道动力显著下降，排泄率测定显示其排泄量明显低于野生型（WT）对照。其次，存在明显的营养物质吸收不良，CF模型果蝇的排泄物中葡萄糖、三酰甘油（TAG）和蛋白质的含量均显著增加。此外，模型果蝇还表现出类似“生长障碍”的全身性能量储备减少表型，在2周龄和4周龄时，其全身TAG和葡萄糖水平均低于WT果蝇。值得注意的是，这种能量储备的减少并非由发育缺陷或摄食量减少引起。最后，仅在肠道中敲低Cftr便足以导致果蝇寿命缩短，凸显了肠道CFTR功能对整体生存的重要性。这些结果表明，果蝇CF肠道模型是研究CF胃肠道表现的强大工具。
CF模型肠道的单细胞核分析
为了进一步表征CF肠道模型，研究人员对WT和CF模型果蝇的中肠进行了单细胞核RNA测序（snRNA-seq）。分析共获得了21个细胞簇，并根据已发表的果蝇肠道细胞图谱进行了注释。UMAP分析未在CF模型中发现独特的细胞簇，但多个簇的细胞数量存在过表达或低表达现象，其中包括增加的肠道干细胞（ISCs），这与先前观察到的肠道增生一致。差异表达基因（DEG）分析显示，在WT与CFTR缺陷的肠道之间，所有已识别的细胞簇中均存在大量DEG，表明两者在转录谱和细胞组成上存在显著差异。有趣的是，许多分泌肽的表达发生改变，提示CF肠道模型可能成为研究CF肠道与其他器官间“对话”的良好模型。其中，CF模型中肠上调的分泌蛋白包括多个已知在Yki激活的肠道肿瘤中发挥关键作用的因子，如Impl2、Pvf1、Itp和Upd3，这暗示CF模型肠道可能具有与CF患者类似的肠癌易感性。特别值得注意的是，在CF偏好的前部肠细胞簇中，差异表达最显著的分泌肽之一是乙酰胆碱酯酶（Ace，人源AChE）。Ace在CF模型肠道中整体表达上调，且在前部肠细胞簇中尤为明显，这一发现通过全肠RT-qPCR得到了确认。Ace通过水解乙酰胆碱（ACh）来抑制胆碱能信号传导。
CF肠道模型中胆碱能信号传导减少
由于Ace会降解胆碱能受体激动剂乙酰胆碱，其表达增加预期会降低对ACh的敏感性。为了测试Cftr缺陷中肠的胆碱能敏感性，研究团队在肠细胞中条件性表达了钙离子（Ca2+）指示剂GCaMP7c并进行离体活体成像。结果显示，与WT肠道相比，CF模型肠道对ACh刺激引起的Ca2+水平升高反应减弱，表明其胆碱能反应迟钝。此外，使用尼古丁（可激活烟碱受体且不被Ace降解）处理也证实，CF模型肠道对尼古丁的反应性亦降低，提示胆碱能信号受损可能也存在于受体水平。snRNA-seq数据和RT-qPCR分析均显示，多种烟碱受体亚基（如β1、β2、α5和α7）的基因表达在CF模型中呈下降趋势。这些数据共同证实，CF模型中胆碱能信号的减弱既源于Ace表达增加，也与烟碱受体亚基水平降低有关。为了验证Ace表达在CF模型胆碱能敏感性中的重要性，研究者在CF背景下同时敲低了Ace。结果显示，当CF模型肠道中的Ace水平降低后，其对ACh的反应性恢复到了WT水平，表明在CF背景下降低Ace表达足以挽救胆碱能信号传导的敏感性。
增强CF模型肠道中的胆碱能信号可挽救多种CF表型
鉴于近期研究显示胆碱能信号对于肠道损伤后恢复稳态至关重要，研究者探讨了调节Ace表达是否能影响CF模型中的肠道增生。实验发现，在CF模型肠道中敲低Ace确实能够减少肠道增殖，表明胆碱能信号减弱是CF肠道中观察到增殖增加的原因之一。更重要的是，通过在CF模型肠道中降低Ace表达来增强胆碱能信号，可以挽救多种CF病理表型：它恢复了肠道转运能力（提高了排泄率）；挽救了2周龄时的全身TAG储备；改善了营养吸收不良（减少了排泄物中的葡萄糖、TAG和蛋白质）；并且修复了受损的肠道屏障功能。肠道屏障功能通过Smurf实验进行评估，该实验显示，35日龄的CF模型果蝇出现蓝色染料渗入血淋巴的比例增加，而敲低Ace则可挽救这种屏障完整性缺陷。这些结果综合表明，在CF模型肠道中观察到的胆碱能信号减少，是导致多种CF病理的关键因素。
Fkh调控CF模型肠道中的Ace转录
鉴于Ace的RNA水平在CF模型肠道中发生变化，研究者进行了一项转录因子筛选，以确定Ace表达是如何在CFTR功能丧失的下游被调控的。通过筛选，他们发现叉头转录因子（fork head， Fkh）是调控CF背景下Ace表达的关键候选因子。Fkh是哺乳动物FOXA1/A2的同源物，而FOXA1/A2已知是肠道中Cftr转录的正向调节因子。生物信息学分析显示，在果蝇胚胎ChIP-seq数据集中，Fkh在Ace启动子区域和内含子区域存在结合峰。功能实验证实，在CF背景下敲低fkh能够降低Ace的mRNA水平。尽管snRNA-seq数据显示fkh的mRNA表达在WT与CF中肠之间差异不大，但Fkh的活性可通过核定位来调节。免疫荧光共聚焦显微镜成像显示，与WT肠道相比，CF模型肠道中Fkh蛋白的核定位显著增加，这与Fkh转录活性增强一致。这种核定位的增加可能与CF模型肠道前部中肠中观察到的mTOR活性降低（通过磷酸化4EBP水平测量）有关，因为mTOR磷酸化可抑制Fkh的核定位。如果Fkh确实调控Ace转录，那么操纵Fkh也应能调节CF病理。实验结果表明，在CF模型中敲低fkh能够降低ISC增殖、增加肠道动力、提高全身TAG储备并增强肠道屏障完整性。然而，与敲低Ace不同，敲低fkh并不能完全挽救营养吸收不良表型（排泄物中的葡萄糖和蛋白质水平无变化，TAG仅部分减少），这可能是因为Fkh的其他转录靶点（如营养转运蛋白）也同时被下调。这些结果表明，CFTR功能丧失下游的Fkh核定位增加，可能通过上调Ace表达来调控CF病理生理。
讨论
本研究证实，果蝇CF肠道模型重现了CF的多种临床病理，包括肠道动力不良、营养吸收不良、全身能量储备减少和肠道屏障功能下降。通过snRNA-seq，研究发现了Cftr缺陷肠细胞中Ace表达上调，这导致了对乙酰胆碱的敏感性降低和胆碱能信号传导减弱。重要的是，通过在Cftr缺陷肠细胞中敲低Ace来增强胆碱能敏感性，可以挽救多种CF临床病理。研究者还确定了FOXA1/A2的同源物Fkh是Ace的推定转录因子，其在Cftr缺陷中肠中的核定位增加。以往研究表明胆碱能信号可以增强CFTR活性，但本研究首次证明CFTR功能也可对胆碱能信号产生反向调节。这种胆碱能信号传导的减少可能阻碍了肠道从CFTR功能丧失造成的持续损伤中恢复稳态。研究结果提示，乙酰胆碱酯酶（AChE）抑制剂或增强胆碱能信号可能成为CF胃肠道疾病的潜在治疗策略，类似于其在炎症性肠病（IBD）中的研究。此外，Fkh（FOXA1/A2）被确定为CF背景下Ace表达的关键调控因子，这为理解CF的遗传修饰因子提供了新线索。FOXA1/A2本身已知能调节CFTR及其他离子通道的表达，因此在CFTR活性降低的背景下，FOXA活性增加可能是一种试图增加CFTR功能的代偿机制。本研究的snRNA-seq数据还揭示了CF模型中大量的DEG和分泌肽变化，为未来研究CF肠道如何影响全身生理以及器官间通讯提供了丰富的线索。总之，这项工作不仅验证了果蝇作为研究CF胃肠道表现的实用模型，还确定了Ace（AChE）和Fkh（FOXA1/A2）作为CF的遗传修饰因子，为开发新的辅助疗法指明了方向。
