: 异源表达Thiomonas delicata亚砷酸氧化酶亚基（AioA与AioB）的生化表征及其在砷酶促修复中的应用潜力分析

《Enzyme and Microbial Technology》：Biochemical characterization of heterologously expressed Thiomonas delicata arsenite oxidase subunits (AioA and AioB)

本研究针对水环境中高毒性的As(III)污染问题，开展了对Thiomonas delicata菌株砷酸氧化酶（Aio）亚基AioA与AioB的异源表达、纯化及功能解析工作。研究证实AioA是主要催化中心，而AioB是关键的电子传递亚基，二者重组后能显著提升酶的催化效率。该工作成功获得了具有高活性的重组酶，并评估了其在不同环境条件下的稳定性和实际应用效能，为开发基于酶学的砷污染生物修复技术奠定了坚实的生化基础。

　　

砷作为一种有毒元素，在自然界中普遍存在，其最危险的形态之一便是三价砷（As(III)）。As(III)不仅毒性远高于五价砷（As(V)），而且在水中溶解度和迁移性更强，这使得从水源中去除As(III)成为一项严峻的全球性环境挑战。传统的物理化学处理方法往往成本高昂或产生二次污染，因此，利用微生物及其酶进行砷的生物转化与修复，展现出了绿色且可持续的应用前景。在这场自然界的“排毒”大战中，一种名为亚砷酸氧化酶（arsenite oxidase， Aio）的微生物酶扮演着关键角色。它能将高毒性的As(III)催化氧化为毒性较低、更容易被吸附或沉淀去除的As(V)。Aio酶通常由两个亚基组成：负责催化反应的大亚基AioA和负责传递电子的小亚基AioB。尽管这种酶在自然界许多微生物中广泛存在，但从一种名为Thiomonas delicata的、特别适应于高砷极端环境（如酸性矿山排水）的细菌中，将其Aio酶的两个亚基分开表达、分别研究其功能和协同效应，此前的研究并不充分。理解这两个“零件”各自的作用以及它们如何“组装”成高效的整体，对于优化其性能并最终设计出高效的砷处理生物催化剂至关重要。

本研究发表在《Enzyme and Microbial Technology》期刊上，来自日本九州大学的研究团队Mahesh Mannacharaju、Soichiro Tanaka和Naoko Okibe，成功地从Thiomonas delicata菌株中克隆了aioA和aioB基因，并在大肠杆菌（Escherichia coli）中实现了异源表达。他们采用的关键技术方法主要包括：利用pRSFDuet-1双表达载体系统进行蛋白质表达，通过包括B-PER试剂和IBSR（Inclusion Body Solubilization Reagent）在内的多种方法优化蛋白质溶解和复性，使用镍柱（Ni-NTA）亲和层析技术纯化带有His标签的重组蛋白，以及运用经典的2,6-二氯吲哚酚钠（DCIP）还原法和米氏动力学模型来测定和表征酶的活性与催化效率。此外，他们还利用电感耦合等离子体发射光谱法（ICP-OES）分析了蛋白质中的金属辅因子（钼和铁）含量，并通过批处理实验评估了纯化酶在实际砷浓度下的氧化性能。

1. 亚砷酸氧化酶亚基的表达、优化与纯化

研究人员构建了分别表达aioB基因以及共表达aioB-aioA基因的重组质粒。他们发现，在16°C、使用0.2 mM IPTG诱导的条件下，AioB亚基能够以可溶形式有效表达，而AioA亚基则几乎全部形成不溶的包涵体。为了获得可溶且有活性的AioA，他们尝试了多种细胞裂解和增溶方法。结果显示，常规的超声裂解、N-十二烷基肌氨酸钠或B-PER试剂处理均无法有效提取AioA。最终，采用B-PER初步裂解后再用IBSR（一种专门用于溶解包涵体的试剂）处理的方法，成功将AioA从包涵体中溶解出来，随后通过过夜透析进行复性，从而获得了可用于后续研究的可溶性AioA蛋白。纯化过程通过镍柱亲和层析完成，得到了高纯度的AioA（约90 kDa）和AioB（约18 kDa）蛋白，电泳图清晰展示了纯化过程。

2. 酶活性测定与动力学分析

对纯化的亚基进行酶活性测定发现，单独的AioA显示出显著的As(III)氧化活性（比活为23 ± 4.4 U/mg），而单独的AioB活性极低（比活为0.8 ± 0.07 U/mg），这证实了AioA是催化反应的核心。当将纯化的AioA和AioB以1:1的摩尔比混合后，酶的催化效率（k_cat/K_m）从AioA单独作用时的769 ± 18 M^-1/s提升至1246 ± 26 M^-1/s，最大反应速度（V_max）也从34 ± 2 μmol/min/mg提高到了38 ± 2 μmol/min/mg。这一结果清晰地表明，尽管AioB自身不直接催化反应，但它通过促进AioA催化中心与电子受体之间的电子传递，显著提升了整个酶复合体的整体催化性能。金属辅因子分析（ICP-OES）显示，纯化的AioA中钼（Mo）含量约为每摩尔蛋白0.79 ± 0.03摩尔，而AioB中铁（Fe）含量约为每摩尔蛋白0.38 ± 0.1摩尔，说明在异源表达体系中，AioA的钼辅因子组装相对较好，而AioB的铁硫簇（Rieske [2Fe-2S] center）组装不完全，但这部分有功能的AioB已足以支持其电子传递功能。

3. pH、温度及添加剂对AioA活性的影响

研究人员系统评估了环境因素对纯化AioA活性的影响。该酶在较宽的pH范围内（pH 4–8）都有活性，但在pH 7.0时活性最高。在温度方面，AioA在40°C时表现出最佳活性，并且在20–50°C的范围内都能保持较高的活性，这表明该酶在温和的环境条件下具有良好的稳定性。通过测试多种金属离子和化学添加剂的影响发现，AioA对大多数常见的金属离子（如K⁺、Ca²⁺、Ni²⁺、Mn²⁺等）和阴离子（如NO₂^-、Cl^-、SO₄^2-）表现出较强的耐受性，其活性基本不受影响或仅轻微下降。然而，非离子型表面活性剂Triton X-100对酶活性有强烈的抑制作用（相对活性降至38%），离子型表面活性剂SDS也有一定的抑制作用（相对活性为75%）。这些特性对于评估该酶在复杂环境水体中的应用潜力至关重要。

4. 批处理模式下AioA对As(III)的氧化性能

为了评估重组AioA在实际应用中的潜力，研究团队进行了批处理氧化实验。结果显示，在酶浓度为100 μg/mL、pH 7.0、40°C的条件下，纯化的AioA能快速氧化As(III)。对于20 mg/L的初始砷浓度，As(III)在15分钟内被完全氧化；对于40 mg/L的浓度，则在60分钟内达到完全氧化。然而，当砷浓度进一步提高至70 mg/L和100 mg/L时，在60分钟内只能实现部分氧化，分别剩余约20 mg/L和55 mg/L的As(III)未被转化。这提示在更高的污染负荷下，可能需要更高的酶剂量或更长的反应时间来实现完全处理。As(V)的生成曲线与As(III)的消耗曲线完全吻合，证实了氧化反应的有效性。

结论与讨论

本研究成功实现了对Thiomonas delicata来源的亚砷酸氧化酶（Aio）两个亚基（AioA和AioB）的系统性异源表达、纯化和功能解析。研究不仅明确了AioA作为核心催化亚基、AioB作为电子传递亚基的分工，更重要的是，通过将两者重组，显著提升了酶的催化效率，这为理解该酶的完整工作机制提供了直接的生化证据。获得的纯化酶AioA在接近中性的pH和中等温度下表现出最佳活性，且对多种环境中共存的金属离子和阴离子具有良好耐受性，这与其来源菌株Thiomonas delicata适应于金属丰富的酸性极端环境的特性相符。批处理实验进一步证明，该重组酶能够在短时间内有效处理环境相关浓度（高达40 mg/L）的砷污染。尽管在高浓度下氧化效率下降，但这指出了未来应用中可以优化的方向，例如通过固定化酶技术、提高酶负载量或优化反应器设计来提升处理能力。总而言之，这项研究不仅深化了我们对亚砷酸氧化酶结构与功能关系的认识，更重要的是，它展示了利用重组酶技术进行砷污染修复的可行性与巨大潜力，为开发高效、专一的酶基或生物催化水处理系统奠定了关键的理论与技术基础。